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目的:肝纤维化是各种慢性刺激或病因所致的肝脏疾病早期共有的病理变化,是一种可逆性的肝损伤修复反应,已有研究证实肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)的活化是肝纤维化发生的关键环节。丹参素是丹参的水溶性有效成分,有着抗心血管、抗氧化、抑制血小板活化等多种药理作用。已有许多研究表明丹参素对于慢性肝脏损伤具有较好的保护作用,大部分都集中于其抗氧化应激作用及改善脂质过氧化。然而,HSC作为肝纤维化发生发展的核心环节,丹参素对其增殖与凋亡的影响及其机制方面的研究却很少。因此本课题将通过建立四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)诱导的肝纤维化大鼠模型,主要从HSC功能的角度探讨丹参素防治大鼠肝纤维化的作用及其机制。方法:将48只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组、CC14模型组、丹参素治疗组(20mg/kg低剂量组,40mg/kg高剂量组),每组12只。除正常对照组外,其余三组分别每周两次使用50%CCl4/橄榄油溶液灌胃(1ml·kg-1),持续8周,建立CCl4肝纤维化模型。丹参素治疗组自造模起开始给药,按其质量每天一次分别腹腔注射丹参素氯化钠溶液20mg/kg及40mg/kg,同时正常对照组及模型组每天一次给予等体积的氯化钠注射液。8周后对所有大鼠进行称重并处死,腹主动脉取血制备血清,采集肝脏组织样品,观察大鼠肝脏形态并称肝重。收集好的大鼠血清使用全自动生化分析仪检测血清中肝功能指标天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,肝纤维化指标透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)、层黏连蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)水平,另外采用羟脯氨酸检测试剂盒检测血清中羟脯氨酸含量。多聚甲醛溶液(4%)固定肝脏组织并作组织病理学检查(HE染色和VG染色);Western blot实验检测肝组织AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70S6K1、p-p70S6K1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase 3和Caspase-3蛋白的表达水平;免疫荧光平行实验考察大鼠肝组织中p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K1、p-MEK、p-ERK、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响;Real-time PCR检测细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)降解、血管生成及调控因子(VEGF、β-FGF、PD-ECGF、MMP-13、TIMP-1、collagen I和collagen Ⅲ)、HSC激活因子(α-SMA,TGF-β,Desmin,Vimentin)及炎症相关因子(Cox-2,IL-1,IL-6,TNF-α)的表达;TUNEL原位细胞凋亡检测HSC的凋亡情况。结果:50%CC14/橄榄油溶液(1ml·kg-1)灌胃8周后,模型组大鼠体重及肝脏指数相比对照组显著升高(P<0.05),丹参素给药组中的大鼠体重和肝脏指数则不同程度的降低(P<0.05)。血清检测表明丹参素能剂量依赖性降低肝功能指标(AST/ALT)水平和肝纤维化指标(HA/CollagenIV/LN/PⅢNP)水平及羟脯氨酸含量(P<0.05)。HE和VG病理组织染色显示,丹参素能有效抑制肝纤维化病理进程。相比模型组,治疗组肝脏组织胶原沉积明显减少,肝纤维化程度有所改善,并且随着剂量增加,改善效果更好。Western blot实验及免疫荧光平行实验结果显示,丹参素可抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6K及MEK/ERK信号通路。p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、p-MEK及p-ERK蛋白表达在治疗组呈剂量依赖性降低(P<0.05),且各组中总AKT、mTOR、p70S6K、MEK、ERK含量水平基本保持不变。Western blot、Real-time PCR、TUNEL原位细胞凋亡检测及免疫组化平行实验显示,丹参素可抑制HSC激活因子(α-SMA,TGF-β,Desmin,Vimentin)表达(P<0.05),调节凋亡相关蛋白(Bcl-2,Bax,Cleaved caspase 3,Caspase-3)的表达水平(P<0.05),从而抑制HSC活化并促进其凋亡(P<0.05)。Real-time PCR实验显示,丹参素可影响细胞外基质调控因子(MMP-13,TIMP-1,Collagen I,CollagenⅢ)及肝窦毛细血管化调控相关因子(VEGF,β-FGF,PD-ECGF)的表达(P<0.05),并降低炎症相关因子(Cox-2,IL-1,IL-6,TNF-α)水平(P<0.05),从而有效调节ECM降解并降低血管生成及肝组织中的炎症浸润。结论:丹参素可通过影响HSC功能抑制CC14诱导的大鼠肝纤维化,并且其作用机制与调节PI3K/AKT/mTOR/p70S6K1及MEK/ERK信号途径有关。