目的:病毒性心肌炎(viral myocardifis,VMC)病程迁延可发展为扩张性心肌病,心肌纤维化是影响病毒性心肌炎预后的关键因素。研究病毒性心肌炎心肌纤维化的发生机制,为病毒性心肌炎治疗提供理论根据。冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是中国传统中药,可以调节免疫、预防肾脏纤维化,是否可以抑制心肌纤维化?是我们选用冬虫夏草作为抑制心肌纤维化药物的最初设想。乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一个重要的信号转导分子,调控蛋白质的生成,影响细胞生长和细胞周期进程,与细胞生长、增殖密切相关,其靶向抑制剂是雷帕霉素(rapamycin,雷帕霉素),mTOR是否与心肌纤维化相关?本实验构建心肌成纤维细胞和Balb/c小鼠模型,从细胞水平和动物水平上研究mTOR在病毒性心肌炎心肌纤维化的表达及作用,以及评价冬虫夏草抗病毒性心肌炎的作用及机制。本实验分为2个部分:(1)mTOR在病毒性心肌成纤维细胞的表达及冬虫夏草提取物抗病毒性心肌成纤维细胞增殖的作用研究材料与方法:体外建立柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)感染心肌成纤维细胞模型,分为对照组、CVB3组、雷帕霉素+CVB3组、冬虫夏草大小不同剂量+CVB3组、冬虫夏草+雷帕霉素+CVB3组,应用mTOR抑制剂雷帕霉素和冬虫夏草干预CVB3感染大鼠心肌成纤维细胞,通过MTT法检测细胞增殖活力,RT-PCR检测CVB3-m RNA、mTOR-m RNA、TGF-β1 m RNA、胶原I-m RNA、胶原III-m RNA,western印迹检测mTOR和mTOR下游标志物P-P70S6K、P-4EBP1、以及TGF-β1、Smad蛋白和胶原-I。结果:1)CVB3可以感染心肌成纤维细胞,发生细胞病变。2)RT-PCR,qRT-PCR检测心肌成纤维细胞mTOR/β-actin光密度值,CVB3组高于对照组,CVB3+雷帕霉素组低于CVB3组,差异均有显著性(P<0.05)。Western Blot检测mTOR蛋白以及下游蛋白P-P70S6K、P-4EBP1,CVB3组P-P70S6K高于对照组,CVB3+雷帕霉素组P-P70S6K低于CVB3组,差异均有显著性(P<0.05);CVB3组P-4EBP1低于对照组,CVB3+雷帕霉素组P-4EBP1高于CVB3组,差异均有显著性(P<0.05)。3)RT-PCR,qRT-PCR检测心肌成纤维细胞I型胶原光密度值,CVB3组高于对照组,CVB3+雷帕霉素组低于CVB3组,差异均有显著性(P<0.05);Western Blot检测I型胶原灰度值。CVB3组高于对照组,CVB3+雷帕霉素组低于CVB3组,差异均有显著性(P<0.05);4)RT-PCR检测心肌成纤维细胞TGF-β1光密度值,Western Blot检测TGF-β1和Smad3灰度值,CVB3组高于对照组,CVB3+雷帕霉素组低于CVB3组,差异均有显著性(P<0.05)。(5)RT-PCR检测心肌成纤维细胞细胞CVB3 m RNA光密度值:CVB3组可以检测到CVB3 m RNA表达,冬虫夏草组低于CVB3组,差异具有显著性(P<0.05)。6)冬虫夏草提取物和虫草素干预CVB3心肌成纤维细胞,心肌成纤维细胞CVB3、mTOR、TGF-β1、胶原-I和胶原m RNA表达较CVB3组均降低,mTOR下游标志物P-P70S6K较CVB3组降低、P-4EBP1较CVB3组升高、TGF-β1、Smad蛋白和胶原-I和胶原–III较CVB3组均降低,差异均具有显著性(P<0.05)。上述作用具有剂量依赖性,大剂量冬虫夏草效果更明显。(2)MTOR在病毒性心肌炎慢性期小鼠的表达及冬虫夏草抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化的作用研究材料与方法:通过采用CVB3(先后2次从腹腔注射病毒的经典方法制造)病毒性心肌炎小鼠慢性期模型。分为正常对照组、模型组、冬虫夏草大小剂量组以及卡托普利对照组,通过统计死亡率;实验60天结束时检测心肌胶原容积分数CVF(MASSON染色),RT-PCR检测心肌mTOR m RNA,western印迹检测mTOR、及mTOR下游标志物P-P70S6K、P-4EBP1,以及TGF、Smad蛋白和心肌组织中胶原-I。结果:1)CVB3病毒性心肌炎小鼠慢性期动物模型建立成功。2)统计各组小鼠死亡率,模型组小鼠死亡数目最多,冬虫夏草大剂量组小鼠死亡数目最少,空白对照组没有死亡,差异具有显著性(P<0.05)。3)心肌病理显示模型组小鼠心肌纤维化较对照组明显,冬虫夏草组小鼠纤维化较模型组减轻,存在量效依赖性。4)心肌组织mTOR m RNA及下游标志物P-P70S6K、P-4EBP1表达:病毒组mTOR m RNA及下游标志物P-P70S6K较正常对照组明显升高,P-4EBP1降低,差异有显著性(P<0.01)。卡托普利组和冬虫夏草大剂量组,与病毒模型组相比较MTOR m RNA、P-P70S6K表达明显降低,P-4EBP1表达升高,差异有显著性(P<0.01);而冬虫夏草大剂量组和小剂量组mTOR m RNA水平相比,剂量依赖性,差异有显著性(P<0.01)。5)心肌组织TGF-β1 m RNA、Smads蛋白表达:病毒模型组的TGF-β1m RNA、Smads蛋白与正常对照组明显升高,差异有显著性(P<0.01)。卡托普利组和冬虫夏草大、小剂量组较病毒模型组明显降低,差异有显著性(P<0.05),而冬虫夏草大剂量组和小剂量组mTOR m RNA水平相比,剂量依赖性,差异有显著性(P<0.01)。6)心肌组织胶原-1和胶原-3的表达。病毒模型组胶原-1和胶原-3的表达较对照组均明显增高,差异有显著性(P<0.01)。卡托普利组和冬虫夏草大、小剂量组与病毒模型组相比胶原-1表达明显降低(P<0.05);且冬虫夏草大剂量组胶原-1表达量与冬虫夏草小剂量组相比有下降,差异有显著性(P<0.05)。结论:1)心肌成纤维细胞可作为CVB3感染的VMC细胞模型。2)CVB3病毒性心肌炎慢性期小鼠模型可以作为研究VCM心肌纤维化动物模型。3)mTOR信号通路活化是CVB3诱导的心肌成纤维细胞增殖机制之一,雷帕霉素是mTOR作用的靶点。4)从细胞和动物水平显示mTOR信号通路参与VCM心肌纤维化,并且可能与TGF-β1、Smad信号通路相互作用。5)冬虫夏草具有抗CVB3作用,具有抑制CVB3心肌成纤维细胞增殖的作用,具有抗VMC小鼠心肌纤维化、降低VMC小鼠死亡率作用,上述作用具有量效依赖性,大剂量效果更明显,其机制之一可能是通过抑制mTOR信号通路,并可能和TGF-β1、Smad信号通路相互作用抑制心肌纤维化。因此,本研究从体外CVB3心肌成纤维细胞模型和体内CVB3病毒性心肌炎小鼠模型实验表明,mTOR通路参与心肌成纤维细胞增殖和病毒性心肌炎心肌纤维化,冬虫夏草具有抗VMC纤维化作用,且有剂量依赖性,其作用机制之一抑制mTOR通路,并可能和TGF-β、Smads通路相互作用,共同参与心肌纤维化。以往的研究表明,VMC心肌纤维化实际是多个因素参与的复杂的生物过程。本研究结果从另一个方面提示,雷帕霉素、冬虫夏草具有抑制mTOR通路参与抗心肌纤维化作用,为寻找治疗VMC心肌纤维化药物提供理论依据和新思路。