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背景:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以对称性多关节炎为主要特征的自身免疫性疾病,基本病理改变为滑膜炎和血管翳,病情晚期致畸致残率高。趋化因子在RA发病过程中具有重要作用,可趋化炎性细胞浸润,诱导滑膜增生、血管形成,导致骨和软骨破坏。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度增生、组织修复及免疫调节作用,并可调节RA患者多种趋化因子的表达,对RA具有治疗作用。间充质干细胞来源的微泡(Mesenchymal stem cells derived Microvesicles,MSC-MVs)是MSCs产生的异质性膜分泌体,可模拟其母体细胞的免疫调节功能,并规避了MSCs相关不良反应,可能成为RA新的治疗手段。目的:评估人脐带间充质干细胞微泡(Microvesicles derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUCMSC-MVs)对胶原诱导关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠趋化因子CCL2/MCP-1、CXCL10/IP-10、CXCL12/SDF-1表达的影响,从趋化因子角度探讨hUCMSC-MVs对RA的作用机制。方法:1.体外培养hUCMSCs,差速离心制备hUCMSC-MVs。2.建立CIA大鼠模型:饲养Wistar大鼠,弗氏完全佐剂加II型胶原乳液2次免疫动物,观察大鼠症状(大体观、关节炎指数、双足肿胀度),评估关节病理改变,建立CIA模型。3.实验分组:将CIA大鼠随机分为CIA对照组、MTX干预组、hUCMSCs干预组、hUCMSC-MVs低浓度组、hUCMSC-MVs高浓度组,并设立正常对照组,每组6只。4.干预方法:hUCMSCs组:大鼠尾静脉注射,剂量为2×10~6个hUCMSCs/Kg/鼠;hUCMSC-MVs组:大鼠尾静脉注射MVs,hUCMSC-MVs低浓度、高浓度组剂量分别为30μg/100μl/鼠、90μg/100μl/鼠;MTX组:大鼠腹腔注射甲氨蝶呤0.9mg/kg,每周1次,共3周;CIA组:以同样方法注射等体积的生理盐水。5.检测指标:测量CIA大鼠体重、双足肿胀度、关节炎指数,评估hUCMSC-MVs是否可改善CIA大鼠关节炎症;用高通量流式多因子检测技术测定各组大鼠血清中CCL2、CXCL10的水平,应用ELISA测定各组大鼠血清中CXCL12水平,应用免疫组化技术检测踝关节滑膜组织中趋化因子CCL2、CXCL10、CXCL12的表达,采用RT-PCR法测定各组踝关节滑膜组织及脾脏CCL2、CXCL10、CXCL12 mRNA水平。结果:1.hUCMSC-MVs干预对CIA大鼠一般情况的影响:1.1 hUCMSC-MVs干预对CIA大鼠体重影响:与正常对照组相比,CIA组大鼠体重增长程度明显降低(P<0.05),干预后CIA大鼠体重增长程度较前改善,42d时,hUCMSC-MVs高浓度组大鼠体重较CIA组明显升高(P<0.05)。1.2 hUCMSC-MVs干预对CIA大鼠关节症状影响:CIA组大鼠较正常对照组足肿胀度明显升高(P<0.05),AI明显升高(P<0.05),干预后CIA大鼠关节肿胀度减轻,AI下降。42d时,MTX组较CIA组足肿胀度、AI明显减低(P<0.05),CIA组与hUCMSCs组、hUCMSC-MVs各组(低、高浓度)足肿胀度、AI相近(P>0.05)。1.3 hUCMSC-MVs对CIA大鼠踝关节病理的影响:正常对照组大鼠关节腔结构清晰,无或少量滑膜增生及炎性细胞浸润;CIA模型组大鼠滑膜增生明显,大量炎性细胞浸润,部分出现软骨破坏。MTX组、hUCMSCs组、hUCMSC-MVs低、高浓度组滑膜增生及炎性细胞浸润明显减少,且高浓度组优于hUCMSCs及MTX组。2.hUCMSC-MVs干预对CIA大鼠血清趋化因子的影响:2.1 hUCMSC-MVs对CIA大鼠血清CXCL10的影响:CIA组血清CXCL10水平较正常对照组升高,但无统计学差异(P>0.05);各干预组血清CXCL10水平接近,与CIA组无显著差异(P>0.05)。2.2 hUCMSC-MVs对CIA大鼠血清CXCL12的影响:CIA组血清CXCL12水平高于正常对照组、MTX组、hUCMSCs组及hUCMSC-MVs低、高浓度组(P<0.05);MTX组血清CXCL12水平与hUCMSCs组相当(P>0.05),且与hUCMSC-MVs低、高浓度组无统计学差异(P>0.05);不同浓度hUCMSC-MVs组血清CXCL12水平相当(P>0.05);2.3 hUCMSC-MVs对CIA大鼠血清CCL2的影响:CIA组血清CCL2水平高于正常对照组、MTX组、hUCMSCs组及hUCMSC-MVs低、高浓度组(P<0.05);MTX组血清CCL2水平与hUCMSCs组相当(P>0.05),且与hUCMSC-MVs低、高浓度组无统计学差异(P>0.05);hUCMSC-MVs不同浓度组之间互相比较,各组血清CCL2水平相当(P>0.05);3.hUCMSC-MVs干预对CIA大鼠脾脏趋化因子的影响:3.1 hUCMSC-MVs对CIA大鼠脾脏CXCL10 mRNA的影响:CIA组大鼠脾脏中CXCL10 m RNA含量高于正常对照组、MTX组、hUCMSC-MVs低浓度组、hUCMSC-MVs高浓度组(P<0.05),与hUCMSCs组无统计学差异(P>0.05);hUCMSC-MVs高、低浓度组CXCL10 mRNA含量相当(P>0.05),与hUCMSCs组无统计学差异(P>0.05)。3.2 hUCMSC-MVs对CIA大鼠脾脏CXCL12mRNA的影响:CIA组脾脏CXCL12 mRNA含量较其他各组均明显升高(P<0.05);MTX组、hUCMSCs组、hUCMSC-MVs低浓度组CXCL12 mRNA含量相当(P>0.05);hUCMSC-MVs高浓度组CXCL12 mRNA水平低于hUCMSC-MVs低浓度组(P<0.05)。3.3 hUCMSC-MVs对CIA大鼠脾脏CCL2mRNA的影响:CIA组脾脏CCL2mRNA含量高于MTX组、hUCMSCs组、hUCMSC-MVs低浓度组、hUCMSC-MVs高浓度组(P<0.05);hUCMSCs组CCL2 mRNA含量与MTX组相当(P>0.05)。与hUCMSCs组比较,hUCMSC-MVs低、高浓度组CCL2 mRNA含量增高,但无统计学差异(P>0.05);不同浓度hUCMSC-MVs组比较,hUCMSC-MVs高、低浓度组CCL2 mRNA含量相当(P>0.05)。4.hUCMSC-MVs干预对CIA大鼠滑膜趋化因子的影响:4.1 hUCMSCs对CIA大鼠踝关节滑膜CXCL10表达的影响:1)蛋白水平:CIA大鼠滑膜组织增生,CXCL10表达强阳性;正常组滑膜中CXCL10呈弱阳性或阴性表达;各干预组滑膜中CXCL10呈弱阳性表达。半定量分析显示,CIA组滑膜中CXCL10表达较正常对照组明显升高(P<0.05);各干预组CXCL10表达较CIA组明显减低(P<0.05);不同浓度hUCMSC-MVs组与MTX组比较,低浓度组滑膜中CXCL10表达明显升高(P<0.05);hUCMSC-MVs各组分别与hUCMSCs组比较,低浓度组滑膜中CXCL10表达明显升高(P<0.05);hUCMSCs组滑膜CXCL10表达与MTX组接近(P>0.05);hUCMSC-MVs各浓度组之间比较,低浓度组滑膜中CXCL10水平高于高浓度组(P<0.05)。2)基因转录水平:CIA组滑膜CXCL10mRNA含量较正常对照组、MTX组、hUCMSCs组、hUCMSC-MVs低浓度组、hUCMSC-MVs高浓度组均明显升高(P<0.05);MSCs组CXCL10mRNA含量低于hUCMSC-MVs低浓度组、hUCMSC-MVs高浓度组(P<0.05);hUCMSC-MVs高浓度组CXCL10mRNA含量低于低浓度组,但无统计学差异(P>0.05)。4.2 hUCMSCs对CIA大鼠踝关节滑膜CXCL12表达的影响:1)蛋白水平:CIA大鼠滑膜组织增生,CXCL12表达强阳性;正常组滑膜中CXCL12呈弱阳性或阴性表达;各干预组滑膜中CXCL12呈弱阳性表达。通过半定量分析,CIA组滑膜中CXCL12表达较正常对照组明显升高(P<0.05);各干预组CXCL12表达较CIA组明显减低(P<0.05);hUCMSC组滑膜CXCL12表达与MTX组接近(P>0.05);不同浓度hUCMSC-MVs组与MTX组比较,低浓度组滑膜中CXCL12表达明显升高(P<0.05);hUCMSC-MVs各组分别与hUCMSCs组比较,低浓度组滑膜中CXCL12表达明显升高(P<0.05);hUCMSC-MVs各浓度组之间比较,低浓度组滑膜中CXCL12水平高于高浓度组(P<0.05)。2)基因转录水平:CIA组滑膜CXCL12 mRNA含量高于其他各组(P<0.05);MTX组与hUCMSCs组相当(P>0.05),低于hUCMSC-MVs低浓度组、hUCMSC-MVs高浓度组(P<0.05);hUCMSCs组CXCL12mRNA含量与hUCMSC-MVs高、低浓度组相似(P>0.05);hUCMSC-MVs高浓度组与hUCMSC-MVs低浓度组CXCL12mRNA含量相当(P>0.05)。4.3 hUCMSCs对CIA大鼠踝关节滑膜CCL2表达的影响:1)蛋白水平:CIA大鼠滑膜组织增生,CCL2表达强阳性;正常组滑膜中CCL2呈弱阳性或阴性表达;各干预组滑膜中CCL2呈弱阳性表达。通过半定量分析,CIA组滑膜中CCL2表达较正常对照组明显升高(P<0.05);各干预组CCL2表达较CIA组明显减低(P<0.05);不同浓度hUCMSC-MVs组与MTX组比较,低浓度组滑膜中CCL2表达明显升高(P<0.05);hUCMSC-MVs各组分别与hUCMSCs组比较,低浓度组滑膜中CCL2表达明显升高(P<0.05);hUCMSC组滑膜CCL2表达与MTX组接近(P>0.05);hUCMSC-MVs各浓度组之间比较,低浓度组滑膜中CCL2水平高于高浓度组(P<0.05)。2)基因转录水平:CIA组滑膜CCL2 mRNA含量高于MTX组、hUCMSCs组、hUCMSC-MVs低浓度组、hUCMSC-MVs高浓度组(P<0.05);与hUCMSC-MVs低浓度组相比,MTX组、hUCMSCs组、hUCMSC-MVs高浓度组CCL2 mRNA含量显著减低(P<0.05);hUCMSC-MVs高浓度组CCL2 mRNA含量与MTX组、hUCMSCs组相当(P>0.05)。结论:1.hUCMSC-MVs可通过抑制CIA大鼠体内趋化因子CCL2、CXCL10、CXCL12的表达,减轻机体炎症反应;2.高浓度hUCMSC-MVs对CIA大鼠体内趋化因子的抑制作用与hUCMSCs及MTX类似。3.高浓度hUCMSC-MVs对滑膜趋化因子的抑制作用优于低浓度hUCMSC-MVs。