论文部分内容阅读
目的： 建立45,XO干细胞系,为探讨特纳综合征的发病机制及X染色体功能提供较好的细胞模型。 方法： 1.45,XO诱导多能干细胞系的建立:采用逆转录病毒载体法将人Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc4个基因转入到染色体核型为45,XO绒毛细胞中,使其重编程为诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS cells)。并对诱导多能干细胞进行核型,个体识别,多能性和体内外分化能力等鉴定。 2.45,XO/46,XX嵌合型羊水干细胞系的建立:采用梯度稀释后低密度种植的方法获得染色体核型为45,XO/46,XX羊水干细胞,体外传代培养,倒置显微镜观察细胞的贴壁生长情况,细胞染色体检查确认核型,流式细胞仪检测羊水干细胞特异性表面标志和细胞周期,进行成骨诱导分化及碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定。 结果： 1.45,XO绒毛细胞在感染后第5天形态上发生变化,感染第15天有干细胞样克隆形成,机械法挑选建系,这些细胞能够长期在体外稳定传代并保持核型45,XO,维持自我更新,AKP染色强阳性,免疫荧光染色显示SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81阳性;RT-PCR示iPS细胞多能性基因Oct4、Sox2、NANOG表达阳性,诱导多能干细胞在体外自然分化可形成三胚层来源细胞;将克隆细胞注射于SCID小鼠皮下形成的畸胎瘤内也有三胚层样结构形成。 2.45,XO/46,XX羊水干细胞在体外培养体系中增殖迅速,流式细胞仪检测羊水干细胞表达CD29、CD44、CD90和CD105间充质干细胞表面标志,不表达造血干细胞标志CD45和CD34;大部分细胞处于G1期,增殖能力强。羊水干细胞经成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性。 结论： 1.利用45,XO绒毛细胞可建立诱导多能干细胞,其在体外扩增、冻存和复苏过程中保持核型稳定、表达胚胎干细胞标志并具有向三胚层分化潜能。 2.分离获得45,XO/46,XX羊水干细胞,其增殖能力强,表现间充质干细胞的特性,在体外可以诱导分化成为骨细胞。