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随着抗生素耐药菌日益增多,迫切需要新的抗菌药物,酮内酯类抗生素在抗感染耐药菌方面最有希望。通过同源重组的方法敲除糖多孢红霉菌A226染色体上KR6基因构建了糖多孢红霉菌M,合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,一种新的酮内类脂类化合物。然而其产量较低,而且产物没有抑菌活性,需进一步提高其产量及糖基化修饰产生出抑菌活性产物。 60Coγ射线辐射诱变既能获得较高的突变率和较宽的突变谱,同时还有利于筛选新的突变型。本试验以糖多孢红霉菌M为出发菌株,以孢子为材料,试验初始糖多孢红霉菌M的孢子悬液浓度为106个/mL,使用60Coγ射线为诱变源,20％甘油吐温、20％DMSO、1％吐温20制备孢子悬液进行辐照处理以纯水为空白对照,稀释涂平板法计数,并根据计数结果计算致死率,选择适宜的溶液制备孢子悬液和适宜的诱变剂量;采用适宜的诱变条件处理,并利用链霉素R3M抗性平板来筛选突变体,发酵培养,取发酵液做枯草杆菌抑菌试验,筛选突变体,计算有效突变率;并研究γ射线对糖多孢红霉菌M的诱变效应。初步研究LiCl诱变及LiCl与60Coγ射线复合诱变糖多孢红霉菌M的诱变效应。 链霉素最低抑制浓度结果表明:随着链霉素浓度的提高,链霉素对糖多孢红霉菌M的抑制作用增强,当链霉素浓度达到100μg/mL时菌株生长完全被抑制,为最小抑制浓度。本试验采用90μg/mL的链霉素抗性平板来筛选抗性突变体,以增大突变株筛选几率。 诱变筛选结果表明:糖多孢红霉菌M对60Coγ射线敏感,剂量越高,存活率越低;使用20％甘油吐温制备孢子悬液时60Coγ射线辐照诱变的效果较好,当辐照剂量为400Gy时,致死率为90.3％,选择为适宜诱变剂量。通过400Gy60Coγ射线辐射结合90μg/mL链霉素抗性筛选获得两株具有抑菌活性产物的突变株,正突变率为1.67‰,均斜面转接5代,其发酵产物抑菌活性基本稳定。 诱变效应观察结果表明:60Coγ射线诱变可以引起糖多孢红霉菌M的生理形态变化,筛选的1203株链霉素抗性突变株中有5株生理形态发生较大变化,形态变异率达到4.16‰,突变株的孢子颜色、产孢时间、可溶色素、菌落致密性等与糖多孢红霉菌M相比具有较大变化。 LiCl、LiCl与60Coγ射线复合诱变结果显示:糖多孢红霉菌M对LiCl比较敏感,随着培养基中LiCl浓度增加,致死率增高;使用LiCl与60Coγ射线复合诱变具有协同作用。 通过60Coγ射线诱变结合链霉素抗性筛选的方法筛选突变体,可以显著提高菌落形态变异率及正突变率。而且通过γ射线诱变得到的突变菌株具有良好的遗传稳定性,大大减轻了筛选的工作量,提高了菌种选育的工作效率。试验结果为进一步诱变选育红霉素高产菌株奠定基础。