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小麦条锈病是一种世界性病害,严重威胁着小麦生产,目前尚未发现成功克隆小麦抗锈基因的文献报道。小麦抗条锈病基因Yr10可抵抗我国目前出现的所有条锈菌生理小种,而且在生产上还基本没有被利用。因此,本文以Yr10的载体品种Moro作材料,首次应用差异显示RT-PCR技术,从小麦中分离了小麦与条锈菌抗性反应过程中相关基因的cDNA片段;并首次以小麦抗条锈病基因Yr10的近等基因系为材料,运用植物抗病基因保守序列策略,探索了分离小麦抗条锈病基因Yr10的候选基因的新途径,取得了以下重要进展: 以小麦条锈菌(Puccinia striiformis West.)菌系75078和CY27分别接种含抗条锈病基因Yr10的小麦品种Moro,组成小麦与条锈菌亲和及不亲和互作组合。采用差异显示RT-PCR 使用3个锚定引物T11MN(M为A、G、C简并碱基,N为A、G或C),与40条随机10聚体引物组合,分析上述处理及其与不接种对照间mRNA水平的差异。发现不同引物组合间的扩增结果差别很大,有的能扩增出很丰富的条带,有的只扩增出稀疏的条带,而且不同引物组合扩增产物间的多态性不同。 对接种后24、48、72和96小时样品的分析,共回收到146条差异带,其中接种后24和48小时样品回收到78条差异带。 进一步将这78个再扩增产物分别与其对应的总cDNA探针进行反向Northern杂交,获得1个在不亲和组合和亲和组合间均表达,而在不接种对照中不表达的片段,将这片段命名为DD-1。将DD-1克隆到T-easy载体上,进行序列测定。DD-1长度为316bp,在GenBank中的注册号为AY015491。同源性检索没有发现与其明显相似的已知序列,推测DD-1为一个新基因片段。 Northern点杂交显示DD-1片段在亲和与不亲和组合中都有表达,但在不亲和组合中表达量较大。接种72小时后,DD-1在亲和组合中表达量减少,而在不亲和组合中表达量无明显变化。 以Yr10的近等基因系作材料,根据多数已克隆R基因都具有的NBS区设计一对简并引物,用Touch down PCR程序扩增它们的cDNA,结果在Yr10/6×Avocet S中稳定出现一条约800bp的条带,而在其背景材料Avocet S中没有这条带。序列分析表明该cDNA片段长度为771bp。核苷酸序列同源性检索发现, 中巳农业科学院傅土学位论文GenBank中有小麦抗条锈基因YrIO的序列(2000年12月登记),本实验获得的 cDNA片段与该 Yr!0基因高度同源(99%),只在 foo mRNA的第 613位的T(差异片段为G)、1006位的G(差异片段为A)和 1062位的G(差异片段为A)不同。氨基酸序列同源性检索发现,该片段编码氨基酸序列与Yrlo蛋白的203-459位氨基酸序列有99%的同源性,只在205位的L(差异片段编码氨基酸为V)不同。此外,该片段编码氨基酸序列还与多个R基因编码蛋白有不同程度的相似性u刁2们。 简易法提取Yr 0/6 x Avocet S其背景材料Avocet S的基因组DNA,根据差异片段序列结果设计一对特异引物,同样用 TOuch down PCR程序进行扩增,得到一条在Yrlo历XAvocet S中稳定出现的约工刀kb的条带,而在其背景材料Av。cet S中没有这条带出现。推测该基因含有一个长度大于 1.okb的内含子。 利用已有资源分别扩增 77fop CDNA片段对应基因的 5’部分和 3’部分。用分别对应于 771hp CDNA片段 ITlltThA序列的 5’端第 12〕0位,和 YrIO基因的第卜 18位的核昔酸序列合成一对特异引物,扩增 771 hp CDNA片段对应基因的 5’部分;用对应于 77fop。DNA片段 mRNA序列第 752J 位,和 Yr10基因的第36113630位的核苦酸序列合成一对特异引物,扩增77fop CDNA片段对应基因的 3’部分。以上述两对引物分别扩增 Yrlo/6XAvocet S总 cDNA和基因组DNA,均得到特异扩增产物,大小与预计产物长度相符合。每对引物从总CDNA和基因组DNA扩增得到的片段大小都相同。 对上述 5’和 3’部分扩增产物进行克隆和测序,加上 771 hp片段的序列,得出 77fop cDNA对应基因的 2475nt全长 InRNA编码区序列,含一个编码 82’个氨基酸的ORF,其编码蛋白的一级结构具有LZ-NBS七RR结构特征。该mRNA对应基因中含有一个长度大于1.okb的内含子。用地高辛标记上述从Yrlo伍XAvocet v总。DNA中扩增的 3’部分 111 sbp片段作为探针,与 ech和 Bdl完全消化基因组DNA杂交,表明该基因是单拷贝的。 本实验用于扩增1118hP DNA片段的引物只与 INO基因特异结合,该片段可以作为yrlo基因理想的分子标记。