在自然界正常条件下,病原、宿主和环境三者间是处于动态平衡,机体表现为健康状态。若三者之间任何一种要素的变化,而另外两种要素未产生相应适应能力时,都会打破平衡而引起宿主健康状况的变化。团头镑(Megalobbrama amblycephala)是我国经济养殖鱼类,具有一系列优良特性,受到市场的广泛欢迎。但实际养殖过程中的多种应激胁迫(高密度、管理不善等),导致病害频发,特别是由嗜水气单胞菌参与引起的暴发性出血病,造成水产养殖业巨大损失。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是水产上的常见致病菌,其致病能力与毒力因子密切相关,一般认为是多功能和多因子协同致病的结果。铁是生命体必需的微量元素,在保持酶活性、电子传递等方面具有重要作用。在大多数环境中铁是有限的资源,高效摄取铁是入侵宿主的微生物生存和致病的关键。多年来,国内外分别对嗜水气单胞菌及团头鲂的铁稳态做了大量研究,对其吸收、转运、储存等部分机制有了较为清晰的认识。但大部分研究仅限于铁限制条件下嗜水气单胞菌部分毒力基因检测、膜蛋白变化、铁代谢等方面,在毒力评价、全基因表达等方面研究较少,且与宿主团头鲂细胞争夺铁的分子机制还不够明确。本实验克隆和分析团头鲂体内转铁蛋白基因,模拟不同应激条件下团头鲂机体铁稳态的变化,观察团头鲂及免疫细胞免疫指标变化情况,阐释嗜水气单胞菌与团头鲂对铁元素竞争的分子机制,为细菌性出血病的治疗提供新的思路和参考依据;同时以嗜水气单胞菌与团头結对铁离子的争夺为切入点,建立铁胁迫模型,模拟生物体内缺铁环境,通过转录组学及蛋白质组学数据分析,更为全面的探究铁限制应激条件对嗜水气单胞菌的生长及毒力的影响。试验内容主要包括以下五个部分:1团头鲂转铁蛋白基因克隆及表达分析本试验旨在研究团头鲂的转铁蛋白(transferrin,Tf)基因序列特征、组织表达分布以及铁注射和嗜水气单胞菌感染对其基因表达的影响。本文利用RACE和RT-PCR等生物技术,克隆获得团头鲂Tf(GenBank登录号:KX698308),其cDNA序列全长2245bp,包含一个1953 bp的开放阅读框,编码650个氨基酸:保守结构预测分析表明团头鲂Tf包括两个相似的结构域,每个结构域分别由两个亚基组成:氨基酸序列分析表明团头坊Tf与GenBank中的鲤科鱼类有较高的相似性,发育树分析显示其与草鱼和鲢鱼关系最为相近;组织表达分布分析表明肝脏中Tf表达量显著高于其他组织(P<0.05)。与对照组相比(生理盐水组),团头鲂注射1×106 CFU/ml嗜水气单胞菌后(48h),肝脏中TfmRNA相对表达水平的总体趋势呈先上升后下降,8h表达量增加1倍,12h达到峰值;血清铁水平呈先下降后恢复正常水平,12h达到最低。注射FeC13后,肝脏TfmRNA相对表达水平的总体趋势是先上升后下降,在4 h增加2倍,8 h达到最高,而血清铁水平先上升后下降,4 h达到峰值水平,8 h恢复注射前水平。通过原核表达和体外CAS平板实验表明,团头鲂Tf具有较好的铁结合活性。从研究中发现,转铁蛋白参与先天免疫,并对外部条件变化如致病性细菌感染和铁离子浓度变化作出快速应答。2应激对团头镑铁稳态相关基因表达及免疫指标的影响本试验旨在探究不同应激源胁迫对鱼体铁稳态相关基因及免疫功能的影响。以团头鲂(250±5g)为研究对象,通过腹腔注射皮质醇、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)来构建不同应激模型,在注射后不同时间点对团头鲂的血液、肝脏进行取样,采用分光光度法测定血清和肝脏中的铁含量,采用RT-PCR技术对肝脏铁稳态相关基因铁调素(hepcidin,Hep)和转铁蛋白(transferrin,Tf)的表达量进行检测。结果显示,与对照组相比,注射皮质醇、LPS后,血浆皮质醇和血糖含量显著升高(P<0.05),血浆铁含量整体呈现先下降后上升的趋势,肝脏铁含量则先上升后下降。基因mRNA检测结果表明,皮质醇和LPS处理下团头鲂肝脏Hep基因和肝脏Tf基因的表达均呈先升高后下降的趋势。为研究团头鲂在应激条件下外周血白细胞免疫应答相关的分子机理,通过细胞活性验证试验选择合适的浓度(皮质醇、DFO、LPS浓度分别为4μg/ml、20μg/ml、62.5 μg/ml),在刺激白细胞0、6、12和24h时测定白细胞ROS、呼吸爆发及免疫应答相关基因的mRNA表达差异,探讨应激源皮质醇、DFO、LPS对团头鲂体外培养免疫细胞活性的影响。发现三种应激胁迫均导致细胞ROS、爆发活性增强,四个免疫基因Hep、Il-1、Il-6、TNF-α表达量均上调。综上所述,皮质醇和LPS注射能导致团头鲂产生应激反应,铁稳态发生变化,通过降低血清铁含量、增加肝脏铁储存、基因转录提高促进转运来应对,适量皮质醇、DFO、LPS应激也能提高外周白细胞的免疫能力。3铁限制胁迫下嗜水气单胞菌体外转录组学研究本试验旨在研究嗜水气单胞菌在铁限制条件下转录组变化情况。通过设置六组不同浓度铁螯合剂2,2’-联吡啶(0,100,200,300,400,500 μmol/L)的TSB液体培养基,研究对嗜水气单胞菌NJ-35的生长影响。结果显示,铁螯合剂2,2’-联吡啶对嗜水气单胞菌生长具有较强的限制作用,显著地降低其稳定期的生长峰值(P<0.05)。500 μM浓度下,24h内完全抑制了嗜水气单胞菌的生长。根据本试验结果,选择200 μM2,2’-联吡啶作为最适铁限制浓度进行后续研究,通过RNA-Seq技术研究转录组的变化。通过分析,共鉴定到4679个基因。在铁限制胁迫下,1.5倍差异表达基因有1204个,其中601个基因差异表达上调,603个基因差异表达下调。对差异表达基因进行GO、KEGG富集分析发现,这些差异基因主要与细菌能量代谢、电子传递和铁离子转运相关通路有关。以rpoB为内参基因,通过实时荧光定量RT-PCR检测20个差异基因的表达情况,结果发现90%的基因变化趋势与转录组数据一致,验证了转录组数据的准确性。4铁限制胁迫下嗜水气单胞菌体外蛋白质组学研究本试验旨在研究嗜水气单胞菌在铁限制条件下蛋白组变化情况。试验材料与转录组研究相同,通过iTraq技术分析共得到328236张二级质谱谱图,40494张肽段匹配到的谱图,共鉴定到16417个肽段,鉴定到的蛋白质总数为2244,其中定量了 2012个蛋白。在铁限制胁迫下,1.5倍差异表达蛋白有236个,其中90个蛋白差异表达上调,146个蛋白差异表达下调,表达下调的蛋白数目多于表达上调的蛋白数目。对差异表达蛋白进行GO、KEGG富集分析发现,这些差异蛋白主要与肠菌素生物合成、铁吸收、离子运输、蛋白转运、能量代谢等相关通路有关,并通过对差异蛋白进行网络互作分析,发现差异蛋白主要集中在能量的合成、ABC转运体等蛋白群中。进一步说明了铁限制胁迫下,嗜水气单胞菌大量合成铁相关蛋白来争夺转运环境中的铁,通过消耗能量转运至细胞内,维持自身生长繁殖需要。为深入阐述嗜水气单胞菌的耐铁分子机制打下坚实的基础。5铁限制胁迫下嗜水气单胞菌体外转录组及蛋白质组学联合分析及对酶活性的影响本试验旨在研究嗜水气单胞菌在铁限制条件下转录组和蛋白组的关联变化及毒力的变化。通过转录组和蛋白组数据联合分析发现,大部分的mRNA和蛋白水平没有超过2倍的变化,证实了基因和蛋白的显著变化及其强相关性。680个对应组基因差异表达而蛋白质无差异,35个对应组蛋白质差异表达但转录基因无差异,6个差异基因和差异蛋白的表达相反,说明大部分差异蛋白与差异基因的变化趋势一致。通过对60个主要的毒力因子进行基因和蛋白聚类分析,发现铁限制胁迫对嗜水气单胞菌的毒力因子的调节有全面的影响。铁含量检测发现,在铁胁迫下嗜水气单胞菌会加强铁吸收转运,导致胞内铁含量显著高于正常组(P<0.05)。通过对嗜水气单胞菌的毒力因子的检测发现,铁限制胁迫下上清液中总蛋白酶活性显著增加至0.36,与正常组0.105相比差异显著(P<0.05),脂肪酶活性和血平板溶血性得到了增加,但差异不显著(P>0.05)。在铁限制条件下,细菌的游泳能力得到显著增强(P<0.05),反映了细菌试图迁移到更适宜的生长区域。通过人工感染实验发现,与正常组相比,铁限制条件下培养的嗜水气单胞菌对健康团头鲂具有更强的致死率。综上所述,在铁限制条件下,嗜水气单胞菌的毒力得到了增强。