论文部分内容阅读
人类巨细胞病毒(HCMV)感染了全世界70%以上的人口。在健康个体中,HCMV感染通常是无症状的,并且受免疫系统控制。HCMV感染在免疫低下时能够被重新激活进而导致威胁生命的疾病发生。HCMV与宿主共同进化,制定了逃避宿主免疫反应并在机体中长期存活的策略。最近的研究表明,HCMV感染通过调节巨噬细胞的免疫活性来介导免疫逃逸。人类巨细胞病毒IE2蛋白是由IE2基因编码和表达的,对于有效的病毒复制至关重要,目前尚不清楚HCMV编码的IE2蛋白在免疫逃逸中发挥的作用。目的:HCMV具有严格的种属特异性,只能把人类作为感染的唯一宿主,没有用于研究HCMV IE2蛋白的动物模型。为了打破HCMV在物种之间的种属特异性,我们构建了UL122转基因小鼠模型来稳定表达IE2蛋白。在此基础上,我们利用UL122转基因小鼠进行免疫逃逸相关机制的研究。本论文旨在确定HCMV IE2对巨噬细胞极化和功能的影响,并探讨GRB2在其中发挥的作用。方法:1.构建了一个UL122转基因小鼠模型来稳定表达IE2蛋白,利用PCR技术对转基因小鼠和野生型小鼠交配的后代进行基因鉴定,并选择20-24周龄的雄性UL122阳性小鼠作为实验组和野生型小鼠作为对照组(每组15只)进行研究。2.利用流式细胞技术检测UL122转基因小鼠和野生型小鼠脾脏和骨髓中的M1和M2型巨噬细胞群体的比例。3.利用中性红染料摄取法来评估巨噬细胞的吞噬功能。4.取UL122转基因小鼠和野生型小鼠的脾脏和骨髓组织,分别利用Western Blot和实时荧光定量PCR技术检测GRB2和IE2的蛋白水平和mRNA水平的表达情况。5.利用实时荧光定量PCR技术检测了UL122转基因小鼠和野生型小鼠的脾脏和骨髓中巨噬细胞极化相关细胞因子IL-4,IFN-γ,IL-13和TNF-α的相对表达水平。结果:1.成功构建了一个UL122转基因小鼠模型并且稳定表达IE2蛋白,通过PCR技术鉴定的阳性鼠作为实验组和野生型C57BL/6小鼠作为对照组(每组n=15只)。2.在小鼠的骨髓和脾脏组织中检测巨噬细胞的吞噬功能,结果表明,在实验组中IE2增强了骨髓巨噬细胞和脾脏巨噬细胞的吞噬功能。3.骨髓巨噬细胞和脾脏巨噬细胞的免疫分型显示,与对照组相比,IE2表达的小鼠中M2型脾脏巨噬细胞的比例显着增加,M1型巨噬细胞减少。表明IE2诱导巨噬细胞极化为抗炎M2型巨噬细胞。4.荧光定量PCR和免疫印迹显示,与野生型对照组相比,转基因小鼠的脾脏和骨髓中IE2和GRB2的m RNA表达水平和蛋白质表达水平均显着上调。5.在小鼠的脾脏和骨髓中评估了极化相关细胞因子IL-4,IFN-γ,IL-13和TNF-α的m RNA表达水平。与对照组相比,在表达IE2的小鼠中M2型极化相关细胞因子IL-4和IL-13均上调,其中IL-4的水平上调显着。结论:1.成功构建的UL122转基因小鼠克服了物种特异性,能够稳定表达IE2蛋白,为研究HCMV与免疫系统之间的相互作用提供了有效途径。2.HCMV IE2能够促进巨噬细胞极化为M2型,并且促进M2型极化相关细胞因子IL-4和IL-13的表达水平增高。3.IE2的长期稳定表达可上调GRB2的表达水平,其升高能够影响巨噬细胞的极化和吞噬功能。