杜氏盐藻(Dunaliella Salina D. salina)为一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，是迄今为止所发现世界上最耐盐的植物之一，其抗逆力极强，能在0.05M—5MNaCl的环境中生存。近年来，杜氏盐藻作为生物反应器的研究已经越来越受到重视，但是，目前有关杜氏盐藻遗传背景的研究报道较少。 热休克蛋白(hsp)70家族是目前已知的最保守的蛋白家族之一。在绿色植物和藻类，不同hsp70基因的编码产物分布在胞浆、叶绿体和线粒体内，参与新生蛋白质的正确折叠、转运及其降解，对细胞的生长、分化和各种环境的适应都起着重要作用。光和热胁迫均可诱导生成大量的hsp70 mRNA。因此，作为诱导表达产物，其hsp70基因启动子已经被用于构建转基因莱茵衣藻表达载体，并得到了成功的转化。本研究根据hsp70在各物种间高度保守这一特点，克隆得到定位在胞浆的杜氏盐藻hsp70基因组DNA全长以及其两侧调控序列，并初步探讨hsp70 mRNA表达水平以及与光和热诱导的关系，为下一步杜氏盐藻表达载体的构建奠定基础。 筛选标记及其合适的启动子是建立杜氏盐藻遗传转化系统的两个先决条件。抗生素抗性基因作为筛选标记基因在微藻类转基因研究中也得到了应用，但是，由于密码子的偏爱性引起的基因沉默现象，常常会使抗生素抗性基因不表达或表达效率较低。此外，杜氏盐藻对在植物细胞和其他绿藻遗传转化研究中用作筛选标记的大多数抗生素具有天然的抗性，这就使筛选转化杜氏盐藻藻株面临更多限制因素。业已发现，杜氏盐藻细胞对除草剂极其敏感。除草剂抗性基因(bar)编码的phosphinothricin acetyl transferase(PAT)能够将草丁磷(phosphinothricin PPT)上的乙酰基团催化形成氨基团，从而解除PPT的郑州大学2004年博创匕论文毒性。自D’ Halluin等在高等植物基因工程研究中应用bar基因作为筛选标记基因以来，由于其容易筛选、成本低和能被有效控制等优点，bar基因已被广泛用于转基因植物研究当中。然而，迄今为止用bar基因作为筛选标记基因筛选转化杜氏盐藻的研究尚未见报道。另一方面，为了使外源基因得到高水平表达，还必须寻找具有高活性的杜氏盐藻内源性启动子。因此，本研究分离和鉴定了在杜氏盐藻中高表达的肌动蛋白基因的5’调节区，构建了一个包含肌动蛋白基因启动子和bar基因的杜氏盐藻表达载体，利用基因枪法转化杜氏盐藻，得到了对即T具有抗性的杜氏盐藻转化藻株。一、杜氏盐藻hsp70基因的克隆和序列分析 方法 1.根据物种间hsp70氨基酸高度同源区域设计简并引物，应用热休克杜氏盐藻CDNA作为PCR反应模板进行PCR扩增，T一A载体克隆扩增产物并测序。 2.根据部分杜氏盐藻hsp70 cDNA片段设计引物，应用RACE方法扩增并克隆该基因CDNA全长及其5’和3’非翻译区(untranslated region UTR)。 3.选用平端限制性内切酶完全消化杜氏盐藻基因组DNA，将之与衔接头连接，分别构建成Dral酶切的文库l(GwLI)、EeoRv酶切的文库2(GwLZ)、Pvu11酶切的文库3(GWL3)和Stul酶切的文库4(GWL4)。 4.根据得到的杜氏盐藻hsp70 CDNA序列，设计5’和3’调控区及跨内含子DNA序列特异性引物。以杜氏盐藻基因组步行文库DNA为模板，分别用基因特异性引物和衔接头引物进行巢式PCR扩增，产物分别经T载体克隆并测序。 5.将诱导时间分成0、15、30、45、60、90和12Omin6个时间段。光诱导时，杜氏盐藻细胞暗培养17h后迅速转移到光照培养箱中依不同的时间段收获细胞，光照条件为2.000 2.500 p m01光子mZs一，。温度诱导为正常温度生长的藻细胞转移到40℃水浴中，而光照条件维持不变，然后在不同的时间收获细胞。Northern印迹检测不同诱导条件下杜氏盐藻h印70 mRNA水平。结果 1.简并引物巢式PCR所扩增的产物为372bp。序列测定结果为一个编码126个氨基酸的片段，此氨基酸序列与多个物种间hSP7O相应氨基酸序列有97%的郑州大学2004年博士论文同源性 2.5’和3，RACE分别得到245 bp和2.skb左右的eDNA片段，然后根据测序结果设计特异引物AF3，与01190一3SiteS Adaptor引物扩增全长CDNA，得到2.6kb左右的特异条带，序列已经由GenBank收录，收录号为AYO78499。序列拼接后显示，假定的5’一UTR和3’一UTR分别为60bp和626bp，多聚A位点上游17bp处发现一个假定的含多聚A的信号序列“从TA从”，1953 bp的开放阅读框架编码着650个氨基酸的连续多肤。推导的氨基酸序列经Genbank Blast分析与数据库中胞桨hsp70序列一致，与莱茵衣藻、人、小麦和啤酒酵母胞浆hsp70的序列一致性分别为83%、80%、81.5%和80.5%。编码氨基酸的密码子存在着明显的倾向性。编码产物中发现一个AQAYLGSDREvKK乃vvw ATP结合位点及一个ARALRRLRTACERAKRTLSS钙调节蛋白结合区。 3.将得到的杜氏盐藻hsP7O cDNA和跨内含子DNA序列进行比较、拼接，得到一个完整的hsp70基因。该基因包括5’和3’侧翼结构序列在内共6812个核昔酸。2639bp的外显子被8个内含子所分割。在推断转录起始点上游245bp及177处分别有为TATA盒和CC从T结构，两个热休克元件分别位于883bp (TCAGAAATTTCATG)和1087bp(CGAGAACGTTCCAA