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研究背景:micro RNAs是一类目前发现在病毒基因组和真核生物里表达的单链小分子非编码蛋白的RNA,长度大约在18至22个碱基。大部分micro RNAs是通过与下游靶m RNA的3端非编码区(3’-UTR)互补结合来使其降解或抑制其翻译过程,从而在转录后水平上调控动植物的生长发育,细胞增殖、分化、凋亡、代谢、免疫反应等生物学进程。肝缺血再灌注损伤是肝移植中常见的发病和死亡原因,多发生于手术、肝移植等临床过程。肝缺血再灌注损伤可以导致严重的肝坏死和炎症反应。研究显示,mi R-191在肝细胞肝癌和其他肝病中表达异常,然而其在肝缺血再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion Injury,IRI)中发挥的作用和分子机制尚不清楚。研究目的:本文通过建立肝缺血再灌注(Liver ischemia/Reperfusion,IRI)小鼠模型及相应细胞H/R(Hypoxia/Reperfusion)模型探讨mi R-191在肝缺血再灌注损伤中的作用机制。研究方法:首先通过体内外实验初步分析mi R-191是否参与IRI或H/R。利用WT小鼠建立IRI模型,检测缺血肝脏组织mi R-191表达变化;同时建立人肝细胞株LO2H/R模型,检测不同时间点LO2 mi R-191表达水平。然后分析mi R-191对IRI肝组织及H/R肝细胞损伤的调节作用。IRI模型后,检测WT和mi R-191 KO小鼠缺血肝组织HE染色、血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)以及炎症因子表达水平,在体比较mi R-191对肝脏损伤程度的影响;体外调控LO2细胞mi R-191的表达并建立H/R模型,流式细胞术分析mi R-191对肝细胞凋亡和细胞周期的影响。进而探讨mi R-191调控IRI及H/R损伤的分子机制。首先寻找该过程中上游调控mi R-191表达的转录因子:通过生信预测IRI及H/R过程中可能结合mi R-191的转录因子,并结合染色质免疫共沉淀(CHIP)及萤光素酶报告(Luciferase)实验,证实IRI及H/R中调控mi R-191表达的转录因子;然后筛选受mi R-191调节并影响该进程的下游靶标:利用生物信息学预测mi R-191可能靶标,Real-time PCR及萤光素酶报告基因在工具细胞293T中验证mi R-191对相关靶标的负调控,最后在IRI小鼠及H/R细胞中,通过蛋白质免疫印迹技术再次确证mi R-191对相关靶标的负调控及相关靶标在该进程的影响。最后通过回复实验,在H/R肝细胞模型中研究mi R-191通过负调控下游靶标、进而影响肝细胞周期及凋亡等表型,从而调节IRI及肝细胞H/R损伤的具体信号通路。研究结果:1.mi R-191在H/R诱导的LO2细胞模型以及WT小鼠IR模型中表达上升。2.IR造模后,miR-191 KO相比WT小鼠组肝损伤面积更小,血清中ALT、AST水平降低,促炎因子水平下降。3.在LO2细胞中调节miR-191表达水平后建立H/R模型,miR-191高表组LO2细胞凋亡数目增加,G0/G1期细胞比例增加,mi R-191低表组LO2细胞凋亡数目减少,G0/G1期细胞比例减少。4.通过ChIP和Luciferase实验,证明HIF1α能够直接结合在miR-191的启动子区域,促进其转录。5.通过luciferase、western blot及RT-PCR实验证明miR-191负调控ZONAB,mi R-191高表达可以抑制ZONAB的水平;mi R-191低表达可进一步增加H/R诱导的ZONAB表达。6.Cyclin D1作为ZONAB的下游因子参与调节缺氧缺血诱导下mi R-191引起的细胞凋亡。研究结论:缺血再灌注过程中,转录因子HIF1α直接结合在mi R-191的启动子上并促进其转录。mi R-191通过抑制ZONAB/Cyclin D1信号,促进了细胞周期阻滞、诱导了细胞凋亡,进而在IRI或H/R过程中发挥重要调控作用。