论文部分内容阅读
研究背景目前哮喘发病率呈现上升趋势，但是哮喘的发病机制尚未完全阐明。哮喘是以气道高反应性、粘液分泌增多和慢性嗜酸性粒细胞炎症为特点。有些报道已证实主要在哮喘患者气道上皮细胞和单核细胞中，一些趋化因子RANTES,MCP-3,MCP-4,eotaxin-1andeotaxin-2等的mRNA表达是增加的。趋化因子是8-10kDa的小分子细胞因子，根据每个蛋白分子一个或两个半胱氨酸残基在N末端的位置可以分为四类，即，CXC,CC,C,和CXXXC。许多CC类趋化因子是由气道上皮细胞产生的。IL13可以诱导上皮细胞CCL11(eotaxin),CCL24(eotaxin-2),andCCL26(eotaxin-3)的表达，且这些因子的表达在哮喘者是增加的。这些CC类趋化因子是嗜酸性粒细胞和嗜碱性细胞表面CCR受体的选择性激动剂。哮喘是以TH2细胞调节为主，分泌的细胞因子与IL4/5/9/13,虽然都与哮喘相关，但是IL13是现在认为最关键的因子。白介素13是由TH2型细胞分泌的分子量为12kDa多效能分子，位于常染色体5q31上。白介素13是富含嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞炎症、粘液上皮化生、组织纤维化和基底重塑强有力的刺激剂。白介素13能够刺激哮喘相关的许多细胞，例如B淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞和气道平滑肌细胞。一些实验也证明，重组白介素13的应用或是肺中白介素13的过表达可以产生哮喘样的气道炎症和气道重塑。许多实验证实白介素13在哮喘中是过表达的，且与哮喘的特征TH2细胞炎症和气道重塑的发病机制相关。因此，我们用IL13刺激气道上皮细胞，模拟哮喘样作用。人intelectin(ITLN)是一种分泌性的糖蛋白，由295个氨基酸和N端寡糖组成，它的基本结构单位是二硫键连接40kDa多肽成的120kDa的三聚体。可分为intelectin-1和2。人intelectin也被称作甘油磷酸肌醇连接的转铁蛋白受体、血管内皮细胞凝集素或网膜素。人ITLN基因位于染色体1q21.3上，含有8个外显子，且人intelectin的mRNA表达于心脏、小肠、结肠和胸腺。属于凝集素类，能够识别特定的细菌壁组分，而不被其他凝集素所识别。所熟知的是它在小肠的潘氏细胞和分泌或是杯状细胞表达。最近，也观察到在气道上皮细胞分泌细胞也有表达。可以识别存在于细菌、真菌和原虫壁上右旋戊糖和呋喃半乳糖残基，但在哺乳动物在不然，说明intelectin在抗原识别中起重要作用。Intelectin-1在小鼠小肠暴露于线旋毛虫后，表达是上调的，其同种型intelectin-2在小肠上皮细胞也被诱导。Intelectin-1是一个TH2细胞调节的抗菌蛋白，在哮喘患者支气管上皮细胞中intelectin-1的基因表达水平是上调的，与IL13的表达上调相关。第一部分Intelectin-1在IL13诱导的气道上皮细胞株A549和16HBE中炎性细胞因子表达中的作用目的：探讨intelectin-1基因在人肺泡/气道上皮细胞分泌炎性因子中的作用。方法：实验用两种细胞系A549和16HBE。分为转染高表达质粒分组为：（A）正常对照组（B）IL13组（C）转染人ITLN1质粒组；转染干扰质粒分组：（A）正常对照组+空质粒组（B）IL13+空质粒组（C）IL13+Itln1-shRNA质粒组。通过RealtimePCR方法检测intelectin-1，CCL5和IL6mRNA的表达。ELISA方法检测细胞上清液中相应因子的蛋白水平表达。地塞米松干预细胞：①对照组+DMSO②IL13+DMSO③DEX100+IL13，然后通过RealtimePCR检测细胞因子ITLN1,CCL5和IL6mRNA的表达。结果：A549细胞中Intelectin-1，CCL5,IL6mRNA的表达水平，人ITLN1组和IL13组较对照组均明显升高，p<0.05。而16HBE细胞Intelectin-1，CCL5,IL6mRNA的表达水平，人ITLN1组较对照组明显增高，P<0.05均有统计学意义；IL13组较对照组Intelectin-1，IL6mRNA表达水平增高，P<0.05；但是IL13组较对照组CCL5mRNA表达水平有增高趋势，但是未有统计意义。细胞A549和16HBE转染人ITLN1-shRNA质粒后，A549和16HBE细胞系：IL13+人ITLN1shRNA质粒组较IL13组intelectin-1,CCL5和IL6的表达明显下降，P<0.05，均有统计学意义。ELISA方法检测蛋白水平：高表达实验，人ITLN质粒组与对照组相比，IL6,CCL5的蛋白表达水平明显升高P<0.05。干扰实验组：IL13组较对照组，CCL5和IL6的蛋白表达水平明显升高P<0.05；IL13+ITLN1-shRNA组较IL13组，CCL5和IL6的蛋白表达水平明显降低P<0.05。在A549细胞，地塞米松+IL13组较IL13组，ITLN1,CCL5和IL6明显减少的，P<0.05;在16HBE细胞，地塞米松组较IL13组，ITLN1,CCL5和IL6均有显著下降，并p<0.05,均有统计学意义。结论：转入人ITLN1高表达质粒后，成功的促使细胞intelectin-1mRNA的高表达。一同检测的因子CCL5和IL6的mRNA和蛋白表达水平也相应的升高，可能与intelectin-1的表达升高有关。转染人ITLN1干扰质粒后，抑制了intelectin-1mRNA的表达,一同检测的因子CCL5和IL6的mRNA和蛋白表达水平也相应的降低。Intelectin-1的表达可能抑制了CCL5和IL6的表达。糖皮质激素可以抑制A549和16HBE细胞中ITLN1,CCL5和IL6的基因表达。由此得出，Intelectin-1在IL-13诱导的气道上皮细胞中炎性细胞因子CCL5和IL-6的表达中有重要的作用。第二部分ERK信号通路在intelectin-1介导的气道上皮细胞炎性细胞因子CCL5和IL6表达中的作用目的：研究探讨intelectin-1参与气道上皮细胞中炎性细胞因子CCL5和IL-6表达的机制。方法：用IL-13和PD98059分别干预人肺上皮细胞株A549和16HBE细胞。PD98059实验分组(1)对照组，(2)IL-13组，(3)IL-13+PD98059组。然后用RealTimePCR方法检测细胞因子CCL5和IL6的mRNA的表达。转染干扰质粒分组：（A）正常对照组+空质粒组（B）IL13+空质粒组（C）IL13+humanITLN1shRNA质粒组，通过RNA干扰的方法抑制IL-13诱导的intelectin-1表达后，用Western-Blot检测intelectin-1,ERK1/2和P-ERK1/2蛋白水平的变化。结果：用PD98059干预IL13刺激的A549和16HBE细胞后,CCL5和IL6的mRNA表达水平，IL13+PD98059组较IL13组明显降低，P<0.05。转染humanITLN1shRNA质粒后，intelectin-1和P-ERK1/2蛋白表达水平，IL-13组较对照组升高，P<0.05；IL-13+shRNA组中intelectin-1和P-ERK1/2蛋白表达较IL-13组降低，P<0.05。结论：ERK1/2的一种抑制剂PD98059，可以阻滞IL-13诱导的CCL5和IL6在A549和16HBE细胞中的表达。而且IL-13的刺激增加了ERK1/2磷酸化以及intelectin-1蛋白表达，但HumanITLLN1-shRNA质粒转染抑制了IL-13诱导的intelectin-1蛋白表达及ERK1/2磷酸化。这些数据显示了ERK1/2通路可以调节IL-13诱导CCL5和IL6的表达，Intelectin-1基因参与了IL-13诱导ERK1/2在A549和16HBE细胞的激活表达。因此我们可以这样认为，Intelectin-1基因可能通过激活ERK1/2信号通路，参与IL-13诱导的CCL5和IL6的表达。