钩端螺旋体病是由革兰氏阴性菌钩端螺旋体(简称钩体)引起的一种全球性、急性的人兽共患传染病。户外活动、自然水灾以及人与动物亲密接触等因素,都会加大人类感染该菌的机率。钩端螺旋体病的临床症状非常宽泛,感染程度可以从亚临床,无黄疸,自限,发热到严重导致死亡的症状。在过去的几十年中,流行病学模式发生了变化,如从农村发展到了城市,原来未见报道的娱乐场所也成了高危地区,这说明了该病是一个非常重要的人兽共患传染病。每年有超过50万例严重的钩端螺旋体病例的报道,其病死率超过10%。缺乏有效的预防措施和诊断方法是控制该病的主要障碍。目前唯一商品化疫苗是钩体的灭活苗或者弱毒苗,但是这些疫苗有如下一些缺陷,如免疫持续时间短,有LPS的毒性反应,需要多次加强免疫,对其他血清型的钩体没有交叉保护力。基于外膜蛋白(OMP)构建的亚单位疫苗是全细胞灭活疫苗的有利替代品,因为它们在各种血清型之间具有抗原的保守性,并且可以把高通量的技术用于疫苗生产。目前,钩端螺旋体外膜蛋白,例如,OmpL1,LipL41,LigA,LigB,Lp0607,Lp1118和Lp1454都已证明可以作为钩端螺旋体病的亚单位候选疫苗。钩端螺旋体的感染是通过其表面被称为粘附素的外膜蛋白与宿主细胞外膜基质(ECM)的结合来启动的。钩体表面的各种粘附素中,Lig蛋白和Lipl32的量最大,在各种血清型中较保守,其特性研究较透彻。Lig蛋白的某些区域如LigCon4, LigCon4-7.5, LigBcen2和Lipl32的C-末端均能与宿主细胞的ECM结合。本试验采用PCR的方法融合了这些片段,并且将其表达、纯化成可溶性的蛋白作为免疫抗原。另外,我们将LigC的氮末端截断分成LigC-J和LigC-K,并且表达和纯化了这些重组蛋白作为候选疫苗。将这些融合蛋白与EMULSIGEN-D佐剂混合皮下注射免疫4周龄的仓鼠,3周后加强免疫。这些重组蛋白的免疫保护效果是用接种高致病性钩体(MLD50~100)的仓鼠模型来评价的,其保护效果由生存率和肺脏出血的情况来评价。试验结果显示,这些融合蛋白对急性感染的动物具有保护作用与PBS对照组相比,差异极显著(P<0.05),可以作为候选疫苗。另外,这些新融合的蛋白和LigC氮末端保护效果均比LigCon(阳性对照)强,其保护效果与抗体水平相关。Lipl32没有保护效果,但是其C-末端与Lig蛋白相连可以稍微延迟动物的死亡。先前试验证明Lp1118,Lp1454和Lp0607三种重组蛋白组合有较好的免疫保护效果,但是再添加LigA重组蛋白后,其免疫保护效果并没有明显增强。这就提示我们仅仅靠简单的增多抗原的种类,并不能达到理想的免疫保护效果。因此,这种新的融合多种重要黏附相关蛋白的策略可能可以作为多抗原疫苗的替代。虽然疫苗具有一定的免疫保护效果,但是其保护率还有待进一步的提高。为了更深入的了解钩体的致病机理,从根本上预防该病的发生,本实验室首次将表型微点阵(PM)引入到钩体的研究中来,旨在从表型角度揭示该菌的致病机理,为该病更好的防治提供依据。PM技术提供了大约2000个培养的条件,这可以用于测定微生物的生长与代谢。这些表型包括200个C源,400个N源,100个P源和S源,100个营养添加剂,一个大范围的PH,离子和渗透压的培养环境。这有助于了解什么条件可以促进微生物生长,什么条件会抑制生长。该技术最早是应用到大肠杆菌,而现在已经被用于1000多种细菌,也包括酵母和丝状真菌的研究。本研究,首次将PM引入到螺旋菌中,并且建立了一套可以用于钩端螺旋体的PM试验规程。同时,应用PM技术比较分析了致病性钩端螺旋体赖型与非致病性钩端螺旋体(突变体Loa22和腐生性双曲钩体)的表型差异。结果显示致病性钩端螺旋体血清型赖型与其无毒突变体Loa22株相比,对PH,渗透压,以及化合物的耐受性基本相同,但是在C,N,P和S方面的代谢以及生物合成途径方面存在着较多表型的差异。腐生性双曲钩体与赖型钩体野生株和突变株Loa22相比,对PH,渗透压,以及化合物的耐受性均差异较大,而且在C,N,P和S方面的代谢以及生物合成方面存在着较多的差异表型。所有这些差异的表型,给致病基因相关的代谢通路提供了依据。同时,抗生素相关的表型可以应用到临床上去。阴性的表型(钩体不能生长)可以用于钩端螺旋体病的治疗,而阳性的表型(不影响生长),可以进行组合用到临床上钩体的分离纯化。总之,由于钩端螺旋体诊断的困难,疫苗一直是控制该病最佳的选择。最近,我们融合了能与ECM结合的LigB和Lipl32功能区,并且将它们作为候选疫苗进行评价获得了较好的免疫保护效果。同时,我们发现了LigC的N末端(LigC-J和LigC-K)重组蛋白也有保护效果。LigC氮末端的重组蛋白的免疫保护机制需要以后进一步的研究。对比分析致病性与非致病性钩端螺旋体的PM结果,显示含有大量差异的表型。这些差异表型有助于发现毒力因子相关的信号通路。本课题组正在进行cDNA微点阵的研究工作,将进一步从转录水平对其致病机理进行阐述。