第一部分A39S突变型DJ-1蛋白对基因表达谱的影响背景DJ-1基因是AREP的致病基因之一,所编码的DJ-1蛋白是个多功能蛋白质,涉及细胞周期调节、基因转录调控、RNA稳定性调节、雄激素受体通路信号转导、肿瘤生成、氧化应激和线粒体功能等多个方面。它能通过调节PSF、TH、AR、Nrf2、p53等基因的转录活性参与多巴胺合成、氧化应激及凋亡等PD相关的病理生理过程。然而,DJ-1突变在PD发病中的具体机制尚不完全清楚。传统的研究方法仅局限于研究某个或某几个可能与DJ-1蛋白存在相互作用的蛋白(或基因)及其之间简单的调控关系,而无法全面认识在PD发生、发展过程中所有与DJ-1相关的蛋白(或基因)及其相互之间的调控关系。基因芯片就是针对这种需要而发展起来的一种分子生物学新技术。目的应用基因芯片技术探讨DJ-1基因致病突变A39S能否通过转录调控活性的变化导致相关基因表达异常而参与PD的发病。方法分别构建稳定表达pCMV-Tag2A空载体、pCMV-Tag2A-DJ-1和pCMV-Tag2A-DJ-1-A39S的HEK293单克隆细胞株;应用基因表达微珠芯片对稳定表达空载体、野生型DJ-1蛋白、A39S突变型DJ-1蛋白的HEK293单克隆细胞株进行差异表达基因筛选。结果与空载体组比较,野生型DJ-1组有14个基因表达上调,28个基因表达下调;A39S突变型DJ-1组有6个基因表达上调,2个基因表达下调。A39S突变型DJ-1组与野生型DJ-1组比较发现UGT2B7基因表达下调。进一步分析发现这些差异表达基因分别参与了信号转导、细胞粘附、基因转录调控、细胞周期、蛋白修饰、细胞凋亡、氧化应激、代谢等生物学过程,提示A39S突变型DJ-1蛋白可能通过直接或间接方式对这些基因进行表达调控,进而影响这些通路的正常功能,参与PD的发病。结论DJ-1基因的A39S突变能改变DJ-1蛋白的转录调控活性。第二部分应用实时荧光定量PCR技术结合DNA直接测序技术检测早发性帕金森综合征患者DJ-1基因突变背景早发性帕金森综合征(early-onset parkinsonism,EOP)是发病年龄较早(一般≤50岁)的具有帕金森特征的一组综合征。EOP除具有帕金森病一般特征外,还可伴有晨轻暮重,休息后减轻,肌张力障碍,多巴胺治疗早期出现运动障碍,腱反射亢进等表现。从遗传方式上看,EOP多呈隐性遗传。目前研究表明,Parkin、DJ-1、PINK1、ATP13A2等基因突变与EOP发病有关。DJ-1基因是EOP的致病基因之一,目前已经发现了包括基因外显子缺失在内的20余种DJ-1基因的致病突变,但其突变频率较低,在EOP中可能仅占1%～2%或是更低。外显子重排突变可能以杂合的形式存在,PCR扩增时这些有重排突变的外显子仍可扩增成片段大小正常的产物,因此用DNA测序等非定量PCR方法不能检测出。为了全面检测DJ-1基因突变,国内外普遍应用定量PCR技术结合DNA测序技术进行DJ-1基因的突变检测。目的探讨中国散发EOP患者DJ-1基因的突变频率及临床特点。方法采用实时荧光定量PCR技术检测DJ-1基因外显子重排突变,结合DNA直接测序技术检测DJ-1基因点突变、小片段插入或/和缺失突变。结果应用实时荧光定量PCR技术结合DNA直接测序技术对160例散发EOP患者进行DJ-1基因突变检测,发现4例EOP患者存在DJ-1基因外显子2的杂合缺失突变,突变频率为2.5%;发现4个已知多态ⅣS4+30T→G、ⅣS4+45 G→A、ⅣS4+46 G→A、ⅣS5+31G→A和一个新的多态ⅣS6+52C→T。未发现DJ-1特异性临床特点。结论1.应用实时荧光定量PCR技术在中国散发EOP患者中发现1个新的DJ-1基因致病突变:2号外显子杂合缺失突变;2.发现DJ-1基因2号外显子重排突变的突变频率为2.5%,提示DJ-1基因外显子重排突变对中国散发性EOP的发病可能具有重要意义;3.应用DNA直接测序技术在中国散发EOP患者中检测出4个已知的DJ-1基因单核甘酸多态和1个新的DJ-1基因单核甘酸多态(ⅣS6+52C→T)。第三部分血清DJ-1蛋白浓度与PD相关性研究背景帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性坏死和路易小体形成,然而,PD的病理改变远早于临床症状的出现,且由于目前PD的早期诊断主要依赖于临床症状,从而与原发性震颤、帕金森叠加综合征、多系统萎缩、进行性核上性麻痹及皮质基底节变性等具有相似临床症状的一些疾病很难鉴别。并且,在PD的诊断确立以后,仍存在对疾病的严重程度及进展速度的判定问题。此外,对于神经保护药物的应用是否能延缓疾病的进程以及延缓的速率都需要更直接、可靠的标准来进行评判。所有这些需求都引起了研究者对于PD的生物标记的兴趣。目前对于PD而言,生物标记的应用主要针对以下三方面:一、对PD作出早期、正确的诊断;二、对PD严重程度及疾病进展速度进行评估;三、评价药物的疗效。DJ-1蛋白在全身广泛分布,并能在脑脊液及血浆、血清中被检出。已有研究表明脑脊液或血浆、血清DJ-1蛋白浓度可能作为某些肿瘤、脑血管疾病及神经变性疾病诊断及病程判断的生物标记。目的检测DJ-1蛋白在中国人群散发性PD患者血清中的表达水平,明确血清DJ-1蛋白浓度是否可作为PD诊断及病程判断的生物标记。方法应用ELISA技术对120名散发PD患者及126名性别、年龄匹配的正常对照进行血清DJ-1蛋白浓度的测定;应用统计学方法对两组测定值进行比较分析。结果PD组(未分期)与对照组血清DJ-1蛋白浓度比较差异无统计学意义(p=0.113);PD组(Hoehn-Yahr分期)与对照组血清DJ-1蛋白浓度比较差异无统计学意义(p=0.441);PD组不同病程与对照组血清DJ-1蛋白浓度比较差异无统计学意义(p=0.145);PD组不同年龄阶段血清DJ-1蛋白浓度比较差异无统计学意义(p=0.834);对照组不同年龄阶段血清DJ-1蛋白浓度比较差异无统计学意义(p=0.059)。结论在国内首次开展了散发PD患者和正常人血清DJ-1蛋白浓度的检测,发现两组之间无明显差异,与疾病的严重程度及病程没有相关性,尚不足以证明血清DJ-1蛋白浓度可以作为PD诊断和病程判断的生物标记。