[BRD7的研究背景]BRD7是我室新近克隆的鼻咽癌相关基因,是一个含Bromodomain的核转录因子。BRD7基因的过表达可通过调节MAPK及Wnt信号通路抑制鼻咽癌的生长,并将鼻咽癌阻滞在G1／S期。前期研究表明,BRD7不仅在鼻咽癌活检组织中表达下调,RT-PCR结果显示BRD7在结直肠癌细胞中也表现出明显的下调。因此,本文在前期工作基础上,通过制备BRD7抗体,进一步分析BRD7在结直肠癌中的表达及其临床意义。[GST-BRD7N.融合蛋白的表达与纯化]从人胎脑文库PCR扩增编码BRD7蛋白N端353个氨基酸的BRD7基因片段,定向克隆到原核表达载体pGEX-4T-1。阳性重组质粒经PCR和测序鉴定,导入大肠杆菌BL21原核表达系统。37℃0.5mM IPTG诱导细菌3.5小时,BL21高效表达预期的64kDa GST-BRD7N融合蛋白。亲和层析纯化后,纯化蛋白的总量超过2 mg/600μl。纯化蛋白的浓度为1.5 mg/ml。在纯化过程中,GST-BRD7N蛋白没有发生降解,保持了完整性。[抗BRD7多克隆抗体的制备]用纯化的GST-BRD7N融合蛋白对两只新西兰兔共进行了5次免疫。在初次免疫100天后,收集抗血清,进行亲和纯化。ELISA结果表明,纯化的兔抗BRD7抗体的滴度为1：1,000,000。SDS-PAGE结果显示,两只兔子的BRD7抗体的浓度分别为300μg／ml和150μg／ml。纯化的BRD7抗体特异识别pCMV-Myc-BRD7转染COS7细胞中分子量为75kDa的全长重组融合蛋白Myc-BRD7。为进一步研究BRD7抗体的特异性,我们还进行了免疫沉淀分析。在由BRD7抗体沉淀的免疫复合物中,用c-Myc抗体检测到了Myc-BRD7蛋白的表达。同样,在由c-Myc抗体沉淀的免疫复合物中,用BRD7抗体也检测到了Myc-BRD7蛋白的表达。[用抗BRD7抗体检测人胚胎组织中BRD7蛋白的组织表达谱]分别采用Western blot和免疫组化方法,分析了BRD7基因在11种人胚胎组织中的蛋白表达情况。Western blot结果显示,BRD7在大多数所检测人胚胎组织中表达。比较不同组织BRD7蛋白表达水平,BRD7蛋白在小脑、心肌、胰脏相对高表达,在肠、肝、肾中度表达,而在大脑、肺、脾、胃相对低表达。免疫组化实验表明,BRD7蛋白在心肌呈强阳性表达,且主要位于细胞浆,而在小脑、胰、肠、肝、肾、大脑、肺、脾、胃则主要分布在细胞核,其中,小脑、胰、肠、肝、肾为强阳性表达,大脑、肺、脾、胃为弱阳性表达。[结直肠癌组织微阵列的制作]成功制作了包括103例原发性结直肠癌病人肿瘤组织和103例配对正常结直肠上皮组织的结直肠癌组织微阵列。每例标本设置3个平行组织点,组织直径0.5mm。组织微阵列切片经HE染色,镜下观察切片质量。结果证实切片厚度适中,细胞形态均一,组织结构无破坏。[结直肠癌BRD7蛋白表达及其临床意义]采用高通量的组织芯片和免疫组化技术相结合的方法,对102例结直肠癌组织和99例匹配正常结直肠上皮组织BRD7蛋白的表达水平进行了检测分析。免疫组化阳性的多数样本(75%)BRD7蛋白主要定位分布在胞核。20%样本BRD7蛋白在胞核和胞浆中均有阳性表达。约5%免疫组化阳性样本BRD7蛋白只在胞浆中表达分布。73例(71.6%)结直肠癌和84例(84.9%)配对正常结直肠上皮细胞中BRD7蛋白表达阳性。和配对正常结直肠上皮组织比较,结直肠癌组织样本中BRD7蛋白阳性表达率显著下调(p=0.023)。进一步分析BRD7蛋白表达水平和结直肠癌临床病理参数之间的关系。发现结直肠癌BRD7蛋白表达缺失与肿瘤大小、Ducks分期、TNM分期、淋巴结转移有关：①肿瘤直径≥4.0cm的病人组织样本中BRD7蛋白阳性表达率明显下调,BRD7蛋白在直径≥4.0 cm肿瘤中阳性表达率为64.8%,而在直径<4.0cm肿瘤中BRD7蛋白阳性表达率为87.1%(p=0.031)；②结直肠癌Ducks分期中,C期(62.0%)和D期(64.0%)的BRD7蛋白阳性表达率显著低于A期(92.9%)和B期(76.5%)(p=0.041)；③TNM分期中,临床Ⅲ期的结直肠癌(64.2%)组织样本中BRD7蛋白阳性表达率明显低于临床Ⅰ期(100%)和临床Ⅱ期(80.0%)(p=0.041)；④伴淋巴结转移(62.0%)的结直肠癌组织中BRD7蛋白阳性表达率显著低于无淋巴结转移的结直肠癌组织(80.8%)(p=0.036)。而BRD7蛋白表达水平和结直肠癌分化水平、肿瘤位置、肿瘤远处转移、病人性别以及病人年龄无关(p>0.05)。综上所述,本文首次研究了BRD7基因在结直肠癌组织中的表达及其临床意义。通过构建pGEX-4T-RD7N重组原核表达载体,获得了纯化的原核诱导表达的GST-BRD7N融合蛋白；通过免疫新西兰兔和免疫吸附实验,制备了高效价和高特异性的抗BRD7多克隆抗体,应用该抗体,检测分析了人胚胎BRD7的组织表达谱；借助成功制作的结直肠癌组织微阵列,高通量检测分析了结直肠癌的BRD7表达水平,发现结直肠癌BRD7蛋白表达显著下调,BRD7表达水平与肿瘤大小、Ducks分期、TNM分期、淋巴结转移显著有关。提示BRD7可能在结直肠癌侵袭、淋巴结转移和临床演进中扮演重要角色。