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本研究采用SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，首次研究了短暂全脑缺血对MLK3、MKK7和JNK3磷酸化的影响，以及K252a对JNK信号通路的中游以及下游的各级蛋白的活化的作用，从而探索JNK信号通路的激活和调控的分子机制，从而K252a具有抗调亡机制得到进一步的阐明。此外对脑缺血中该通路信号调控支架蛋白JIP1的表达及其与相关激酶的结合进行了初步研究。初步为临床治疗脑缺血提供科学的理论依据。
1.缺血/复灌后海马MLK3表达、磷酸化变化以及K252a对其活性的影响采用SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，用抗磷酸化MLK3，、MKK7、JNK3的特异性抗体，采用免疫印迹法测定缺血/复灌后不同时间点海马CA1区和CA3/DG区MLK3、MKK7、JNK3的表达与活性变化规律。结果显示：在缺血15分钟分别复灌0分钟、30分钟、3小时、6小时、12小时、1天、3天的大鼠海马中MLK3，MKK7，JNK3的蛋白表达没有明显变化，但MLK3在CA1区被激活，且有两个活化峰(在复灌30分钟和6小时)。MKK7，JNK3在CA1区的活化也有两次高峰，第一次高峰都是复灌30分钟，第二次高峰分别是1天和3天。而在CA3/DG区MLK3、MKK7、JNK3没有被激活。为了探明K252a是否对MLK3、MKK7、JNK3的活化有影响，我们使用了K252a进行脑室注射，有趣的是我们发现K252a不能有效地抑制复灌早期MLK3、MKK7、JNK3即复灌30分钟的激活，却可有效地抑制复灌后期MLK3、MKK7、JNK3即复灌6小时、1天、3天的活化。提示：K252a可能通过抑制MLK3-MKK7-JNK3信号通路复灌晚期的激活从而起神经保护作用。结合我们实验室以前的研究结果，即抗氧化剂NAC对短暂全脑缺血海马CA1区MLK3、MKK7、JNK3复灌早期激活有抑制作用，即MLK3、MKK7、JNK3复灌早期激活与氧化应激有关。推测MLK3-MKK7-JNK3信号通路的激活不同时期有着不同的激活机制。
2.K252a对脑缺血/复灌后海马JNK下游C-jun、Bcl-2、Caspase3的表达、活性变化的影响
结合本实验室以前的研究结果，即用抗磷酸化C-jun及Bcl-2的特异性抗体，采用免疫印迹法测定缺血/复灌后不同时间点海马CA1区和CA3/DG区C-jun，Bcl-2的表达与活性变化规律。结果显示：Bcl-2在缺血/复灌后海马各脑区蛋白表达水平不变，但Bcl-2在CA1区被激活，且仅有一个活化峰(在复灌6小时时)。而在CA3/DG区Bcl-2没有激活。C-jun在CA1区被激活，在缺血/复灌后海马CA1区蛋白表达水平也改变，与激活的趋势相似。Caspase3在CA1区被激活，其激活方式是裂解为2个片段。为了探明K252a对JNK下游C-jun、Bcl-2、Caspase3的表达、活性变化的影响，我们使用K252a进行脑室注射，有趣的是，我们发现K252a可以有效地抑制CA1区C-jun、Bcl-2、Caspase3复灌相应活化峰值即6小时、6小时、3天的激活，却对C-jun、Bcl-2的表达没有影响。提示：K252a可能通过抑制JNK下游核通路(C-jun)和非核通路(Bcl-2)以及最终的凋亡通路(Caspase3)起神经保护作用。
3.在脑缺血期间，Akt1通过负调MLK3抑制JNK3的活化。
首先我们用免疫印记的方法检测Akt1、MLK3、JNK3在缺血期间的活化以及蛋白表达情况。在缺血5、10、15、30分钟大鼠海马中Akt1，MLK3，JNK3的蛋白表达没有明显变化。然而在缺血过程中Akt1的活性逐渐降低，在缺血30分钟达到低峰，而MLK3、JNK3的活性逐渐升高，在缺血30分钟达到活化高峰。为了进一步探明Akt1的激活与MLK3和JNK3活化抑制的关系，我们采用Akt1上游蛋白PI-3K的抑制剂LY294002进行脑室注射，发现LY294002可以有效地抑制Akt1的激活，提高MLK3，JNK3的活化。结果提示：Akt1可能通过负调MLK3的活化进而抑制JNK3的活化。
4.在脑缺血期间，Akt1通过调节与JIP-1的结合来调节JNK3的活化。
为了研究Akt1是否通过调节其与支架蛋白JIP-1的结合进而与JNK信号通路发生对话，我们采用免疫印迹和免疫共沉淀方法检测JIP-1的蛋白表达及其与Akt1、MLK3和JNK3的共结合。结果表明，JIP-1在缺血各时间点表达不变，但是JIP1与Akt1、MLK3结合和与JNK3结合的趋势相反，即在基础状态下，即对照组中，JIP1与Akt1、MLK3结合最高而与JNK3的结合最少，JNK3的活性最低。随着缺血时间的延长，JIP1与Akt1，MLK3结合越来越少，却与JNK3的结合增多，同时JNK3被逐渐激活。由此可见脑缺血刺激下，Akt1从支架蛋白JIP1上逐渐解离而使JNK3与JIP1结合增多，进而启动JNK的激活。而NAC不但对JIP1与Akt1、MLK3、及JNK3的结合有影响，对JNK3的活化也有抑制作用。结果提示，Akt1通过与JIP1的解离进一步激活JNK3，这个过程与氧化应激有密切的关系。
结论：短暂全脑缺血/复灌能引起MLK3-MKK7-JNK3通路的双峰激活，而对JNK下游C-jun、Bcl-2、Caspase3仅有单峰激活。K252a仅对MLK3-MKK7-JNK3复灌晚期激活以及C-jun、Bcl-2、Caspase3的活化有明显的抑制作用。结合本室以前的实验结果和相关文献，结果提示：MLK3-MKK7-JNK3信号通路在缺血复灌晚期可能参与迟发性缺血脑损伤，进而通过JNK下游核通路，非核通路引起最终的凋亡。而早期MLK3-MKK7-JNK的激活与氧自由基的产生有关。另外，Akt1可以通过负调MLK3的活化来调节JNK3的激活，同时，也可以通过与JIP-1的解离来使JNK3与JIP1结合增多从而进一步激活JNK3。