【研究背景】面神经自茎乳孔穿出颞骨岩部后,由于其走行表浅且解剖位置特殊,易受到面部外伤或临近区域手术的损伤,导致由其支配的面部表情肌部分或完全的功能障碍,对患者的身心及生活造成重大影响[1]。因此,长期以来,面神经的损伤修复机制一直是各相关学科研究的热点之一,其研究的主要方向通常围绕于物理、化学以及生物因素所带给神经元及其轴索的直接损伤[2-3]。而对于各种致伤因素所导致的面神经继发性水肿的形成机制,以及在曲折狭窄且坚硬的面神经管内诱发类似于Bell’s面瘫时的“水肿-缺血-水肿”的恶性循环所带来的伤害的可能性却研究甚少。水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一组以介导细胞水转运为主要功能的膜蛋白家族,至今发现有AQP0～12,共13个成员,分布于全身各个组织器官,并被证明与各个组织器官的水肿形成和消除有密切关系[4]。其中,在周围神经系统中,目前发现主要表达分布有AQP1蛋白[5],但其具体的功能及作用机制尚不清楚。本课题研究并初步确定了AQP1在面神经管内的表达分布情况,并对面神经离断伤后在各个不同时间点面神经管内继发性水肿程度以及AQP1蛋白表达水平的变化进行了观察,初步探讨了面神经水肿与AQP1蛋白变化水平的关系,为今后进一步明确面神经水肿性损伤的作用和机制提供理论依据。【目的】(1)采用耳下切口入路构建小鼠面神经离断模型,并通过行为学观察、电生理检测,以及面神经核团组织切片观察对其预后进行评估,为后续实验提供可靠而稳定的动物模型;(2)采用解剖学观察和组织切片染色的方法,明确面神经管及面神经颞骨段的解剖学特征,并对面神经离断术后不同时间点面神经迷路段神经水肿程度的变化情况进行观测;(3)采用免疫组化染色、Western Blot以及RT-PCR的方法,对AQP1在面神经组织上的表达分布及在面神经离断术后不同时间点的蛋白及基因表达变化情况进行观测;(4)探讨AQP1蛋白对面神经管内面神经水肿的可能性作用。【方法】(1)小鼠面神经离断模型的构建及评估1、对BALB/c小鼠的面神经走形及其毗邻组织行解剖学研究,明确切口入路位置及手术方法;2、将20只BALB/c小鼠随机分为手术组及假手术组,并以左侧为手术侧,右侧为自身对照侧,利用耳下切口入路构建小鼠面神经离断模型;3、于术前、术中及取材前检测手术侧面神经的复合肌肉动作电位(compound muscle action potential, CMAP),并分别于术后1天、2天、7天、14天、28天对两组小鼠面神经功能进行行为学评分;4、于术后28天,对两组小鼠进行灌注、固定后,取包含面神经核团区的脑干部位行系统连续冰冻切片,每5张取1张,并对其行甲苯胺蓝(toluidine blue)染色,对核团区神经元进行计数,并以每只动物一套切片,对手术侧与对照侧神经元总数进行student-t检验,P<0.05,认为有显著性差异。(2)面神经管内神经水肿程度的变化趋势1、通过解剖学研究面神经管内各节段神经的走形,并对正常小鼠的脱钙头颅颞骨段进行连续冰冻切片,观察面神经管各节段的形态,明确实验观测评价部位;2、将30只BALB/c小鼠按术后处死取材的时间不同,分为A(术后即时)、B(术后6小时)、C(术后1天)、D(术后3天)、E(术后5天)和F(术后7天)组,每组5只。采用耳下切口入路构建面神经离断模型,并根据分组时间进行灌注、固定,切取其双侧颞骨段进行脱钙;3、对各组脱钙头颅颞骨段观测部位进行连续冰冻切片,取相邻的2张,分别组成两套切片,一套用于观测面神经水肿情况;将另一套归入下一阶段实验,用于观察AQP1蛋白原位表达变化情况;4、分别测量各组观测部位切片的面神经与面神经管截面积的比值(FN/FC),并对其值行上述统计学方法分析,了解面神经离断后面神经管内神经水肿程度的时相性变化趋势。(3)面神经管内AQP1的表达与变化趋势1、解剖获取面神经颞骨段游离神经组织进行组织切片,并结合上一阶段实验获取的各时间组的组织切片行AQP1染色,观察AQP1的分布和表达,初步判断AQP1的时相性变化;2、取30只BALB/c小鼠,采用与上一阶段实验相同的分组方法,将其分为A、B、C、D、E和F组,每组5只。采用耳下切口入路构建面神经离断模型,并根据分组时间获取颞骨段面神经组织,在液氮中进行组织匀浆后,分为两等份,一份用于Western Blot,另一份用于RT-PCR;3、采用Western Blot法对颞骨段面神经组织内的AQP1蛋白的表达进行检测,并对其结果进行上述统计学方法分析,了解AQP1蛋白水平的时相性变化趋势;4、采用RT-PCR法对颞骨段面神经组织内的AQP1 mRNA的表达进行检测,并对其结果进行上述统计学方法分析,了解AQP1基因表达水平的时相性变化趋势。【结果】(1)通过对面神经颅外段的解剖学研究,采用耳下切口入路,构建了小鼠面神经离断模型;(2)通过对面神经管的连续切片观察,明确了对面神经管迷路段的观察定位;并通过测量面神经管迷路段的FN/FC比值,了解小鼠面神经离断模型术后不同时间点的面神经管内神经的水肿程度;通过对其结果分析发现,面神经管内神经的水肿自离断术后6小时即开始出现,并于术后3天时达到峰值,随后开始逐渐消退,至术后7天时,仍有轻微水肿。(3)采用免疫组化、Western Blot及RT-PCR方法的检测,首次证实了AQP1在颞骨段面神经组织内的分布和表达;免疫组化观察发现分布于面神经管迷路段的面神经组织内的AQP1呈环状包绕神经纤维,并在离断术后可呈现出时相性变化。(4)通过进一步对术后各时间点的颞骨段面神经组织的Western Blot检测的结果分析发现,颞骨段面神经组织内的AQP1蛋白水平于术后6小时已开始出现增强,并在术后3天时达到峰值,随后开始减弱。(5)采用RT-PCR的方法,对术后不同时间点的颞骨段面神经组织内的AQP1 mRNA水平进行检测,也发现其呈现出规律性时相性变化(术后逐渐出现上调,至术后3天时达到峰值,随后逐渐下降)。【结论】(1)证实了采用耳下切口入路的手术方式不仅可获得稳定的实验结果,而且与经典的耳后切口入路相比较,具有损伤小、面神经易探查、暴露充分以及手术操作空间相对较大的优点。(2)对面神经管内神经水肿的变化情况进行了观察,明确了水肿的观测位置;发现面神经因离断损伤可导致其近端出现继发性水肿,并随时间的变化出现由逐渐加重至逐渐消退的过程,其水肿程度最明显的时间点大约在损伤后3天,为今后的水肿性损伤机制研究奠定了基础。(3)首次证实了AQP1在颞骨段面神经组织内的分布和表达,并发现其表达变化与面神经管内神经水肿程度的变化趋势高度一致性,提示其与面神经管内继发性水肿可能密切相关。