脓毒症（Sepsis）是机体在遭受严重创伤、手术、休克以及感染后常见的并发症,是ICU住院病人主要的死亡原因之一。脓毒症的诊断标准包含感染、器官障碍、血流动力学以及炎症反应等多项指标及参数。但是由于其过度复杂的标准,在临床中也为对病人的诊断造成了一定的难度。目前,根据脓毒症相关的序贯器官衰竭评分（Sequential（sepsis-related）organ failure assessment,SOFA）判断,指标有呼吸频率、患者意识状态是否改变和收缩压的数值。虽然临床上对脓毒症病人有一些治疗方案,但大多数都是以抗感染、器官保护与维持和液体复苏为主。因此,加强对脓毒症病理机制的探讨,寻找新的药物靶点,建立有效的临床治疗方案是目前研究脓毒症的重要目标。在脓毒症病人中,内皮细胞的激活引发的广泛血管通透性增加、炎症反应和机体内环境稳态的失衡是造成多器官衰竭的主要病理机制。内皮细胞是机体监测外来有害物质入侵的哨岗细胞,可以通过激活模式识别受体来启动机体的免疫应答。脓毒症感染后,内皮细胞可以释放多种促炎因子,上调内皮细胞粘附分子E/P selectin和细胞间粘附分子ICAM-1的表达。这些粘附分子的高表达,可以使在血管内滚动的中性粒细胞黏附在血管内皮细胞表面,继而穿过内皮细胞到达炎症反应病灶。内皮细胞持续性的活化,可以导致大量的中性粒细胞向炎症组织入侵、机体内发生高度炎症反应、组织损伤和器官功能障碍。因此,在机体受到损伤后,维持和重建血管内皮细胞内环境的稳态是脓毒症预后的重要治疗方向。NF-B的激活在调节炎症基因和黏附分子的表达中发挥了重要的作用。NF-B的激活是一个级联反应,LPS与TLR4受体结合随即激活My D88依赖和非My D88依赖通路。My D88与IRAK结合,募集TRAF6后与TAK1结合形成复合物。TAK1再激活IKK使I Bα发生磷酸化,释放NF-B到细胞核内,随后调节下游靶基因。TRAF6是介导TNF受体、IL-1家族和大部分的Toll样受体（TLR1-TLR9）信号通路的重要分子,也是连接NF-B信号通路的关键蛋白。TRAF6的泛素化是调控TRAF6表达和TAK1激活的关键步骤。TRAF6可以通过其RING环指结构域的E3泛素连接酶发生泛素化。TRAF6在K48位点的泛素化可以使其被降解,K63位点的泛素化是激活TAK1和NF-B信号通路的重要指标。Hippo信号通路是由一系列的发生级联反应的丝氨酸激酶组成,主要调节控制生长的基因的表达。在哺乳动物中,Hippo信号通路的MST1/2与SAV1形成复合物激活并磷酸化LATS1/2,使其继续磷酸化下游的分子YAP/TAZ并滞留在细胞浆中。去磷酸化的YAP/TAZ可以转移到细胞核中调控下游靶基因发挥调节细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。YAP最早被发现是一个致癌基因,作为一个转录共激活因子,YAP可以参与细胞的增殖,存活和分化等功能。YAP的持续激活或者上游负调控蛋白的缺失可以导致组织过度生长和肿瘤的发生。Hippo/YAP信号通路在控制细胞增殖方面有发挥了重要的作用,但是关于Hippo/YAP信号通路在免疫炎症调节中的作用却少有报道。有文献报道,在果蝇中,革兰氏阳性菌可以通过Toll依赖的通路激活Hippo信号通路,提示Hippo信号通路在炎症中也发挥了调节作用。基于这些前题条件,本论文第一部分工作首先使用不同的炎症介质刺激内皮细胞和小鼠,观察炎症反应发生后是否会引起YAP表达的变化。随后在内皮细胞中敲除或过表达YAP观察对炎症反应的影响。研究结果表明,刺激剂LPS、TNF-α或H₂O₂均可以引起内皮细胞YAP表达的上调,在脓毒症小鼠中也可以引起肺组织YAP含量增加。内皮细胞中敲除YAP会使炎症加重;反之,过表达YAP会抑制炎症反应的发生。因此,YAP可能在炎症反应中发挥了重要的调节作用。论文第二部分内容主要是脓毒症整体动物模型的研究,本部分使用内皮细胞特异性敲除YAP的小鼠,腹腔注射LPS和CLP模型,与野生型小鼠相比观察内皮细胞YAP对炎症反应和心功能的影响。研究结果显示,内皮细胞YAP缺失会导致LPS诱导的小鼠脓毒症反应加重,增加小鼠肺损伤和心血管系统损伤。基于前两部分的研究结果,第三部分的研究内容主要集中在探讨YAP对炎症反应调节作用的机制。在细胞中寻找TLR4信号通路中与YAP之间可能存在相互作用的蛋白并分析其可能的结合位点,最后用整体动物模型验证YAP对炎症的调节作用确实是依赖该靶蛋白。研究结果表明,YAP与TRAF6之间存在直接的相互作用,且在动物体内干扰掉TRAF6的表达可以逆转内皮细胞YAP缺失所致的高炎症反应。第一部分YAP与炎症发生的相关性研究目的:研究YAP与炎症反应发生的相关性及YAP对炎症影响。方法:原代培养人脐静脉血管内皮细胞,Western blotting和实时定量PCR检测在炎症介质LPS、TNF-α或H₂O₂的刺激下,内皮细胞中YAP的蛋白或m RNA水平表达的变化。使用8-12周的野生型小鼠（wild type,WT,YAPf/f）,腹腔注射5 mg/kg的LPS建立脓毒症模型,4小时后分离肺内皮和非内皮细胞与对照组相比观察YAP表达的变化。用CRISPR/Cas9系统敲除内皮细胞中YAP基因,再用LPS刺激细胞,收集细胞上清用ELISA试剂盒检测IL-6和IL-1β的分泌水平。与对照组相比观察YAP缺失后对LPS诱导的炎症反应的影响。同时,再将用Flag标记的YAP质粒转染到内皮细胞中,用同样的方法观察内皮细胞YAP过表达对炎症因子IL-6和IL-1β释放水平的影响。除了对炎症因子的检测外,还分离了人血中性粒细胞,分别观察在内皮细胞YAP缺失或过表达的情况下对中性粒细胞黏附于内皮细胞表面或迁移穿过内皮细胞数量的影响。结果:（1）LPS刺激内皮细胞会引起YAP蛋白水平发生时间依赖性的改变,内皮细胞中YAP蛋白含量先升高,在LPS刺激4小时其含量表达最高,约是基础状态下表达含量的7倍。LPS刺激4小时后YAP的表达逐渐降低,在24小时处YAP的含量基本回落到基础状态。（2）YAP在m RNA水平表达的变化与蛋白水平类似,LPS刺激后YAP的m RNA含量先升高,在刺激后8小时处YAP m RNA含量达到最高峰,随后开始下降。（3）不同的炎症介质LPS、TNF-α和H₂O₂刺激内皮细胞4小时,均可以引起YAP蛋白水平的升高。（4）野生型小鼠腹腔注射LPS（5 mg/kg）4小时后,YAP在肺内皮与非内皮细胞的表达水平均显著增高。（5）内皮细胞YAP缺失会加重LPS诱导的细胞炎症因子IL-6和IL-1β释放含量的显著增加。与之相反,内皮细胞中YAP过表达会显著抑制LPS诱导的炎症因子IL-6和IL-1β的释放。（6）内皮细胞YAP缺失会显著增加基础状态下和LPS刺激所引起的细胞黏附分子ICAM-1和E-selectin的表达。且与对照组相比,内皮细胞敲除YAP后其细胞表面PMN的黏附数量和穿过内皮细胞发生迁移的PMN数量均显著升高。（7）与YAP缺失所引起的炎症反应相反,内皮细胞YAP过表达会显著抑制基础状态下和LPS刺激所引起的细胞黏附分子ICAM-1和E-selectin的表达。结论:（1）炎症介质可以引起人内皮细胞和小鼠肺组织中YAP表达的增高。（2）YAP抑制LPS所诱导的内皮细胞炎症因子的释放。（3）YAP负性调控内皮细胞黏附因子的表达以及中性粒细胞与内皮细胞之间的黏附和迁移。第二部分内皮细胞YAP基因缺失对小鼠脓毒症发生的影响目的:研究内皮细胞YAP对小鼠脓毒症发生的影响。方法:应用Cre-Loxp系统构建内皮细胞YAP特异性敲除小鼠（YAP-CKO）,并提取鼠尾DNA鉴定YAPf/f和Cre基因的表达。同时分离肺内皮与肺非内皮细胞,用Western Blotting和实时定量PCR检测内皮细胞与非内皮细胞和肺组织中YAP蛋白和m RNA表达的水平,以此检测小鼠内皮细胞中YAP特异性敲除的效率。对4、8和40周龄的WT（YAPf/f）与YAP-CKO小鼠进行体重监测,同时随时记录小鼠的繁殖情况和生存寿命。对8-12周龄的WT和YAP-CKO小鼠进行多脏器组织的形态、大小、脏器系数和肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage,BAL）中各细胞含量的比较。WT与YAP-CKO小鼠腹腔注射5 mg/kg LPS制备脓毒症模型,并于LPS刺激0、6和24小时取小鼠肺泡灌洗液,比较WT和YAP-CKO小鼠BAL中总细胞和中性粒细胞的含量。同时,抽取小鼠静脉血并分离得到血清,用ELISA试剂盒检测WT与YAP-CKO小鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的含量。LPS刺激小鼠24小时后,对肺组织灌流去除血管中的红细胞并进行H&E染色,显微镜下观察肺组织的改变并进行肺损伤评分。LPS刺激小鼠24小时后,静脉注射伊文思蓝（Evan’s Blue）溶液,40分钟后取下肺组织灌流,匀浆提取并计算肺组织中伊文思蓝的含量。小鼠腹腔注射致死剂量20 mg/kg LPS,观察并比较WT与YAP-CKO小鼠的生存率。在盲肠结扎穿孔（CLP）术后5小时和6小时分别对小鼠的血压和心脏进行超声检测,评估脓毒症后心功能水平。对WT与YAP-CKO小鼠进行骨髓移植（Bone marrow transplantation,BMT）,将Ly5.1小鼠的骨髓细胞（Bone marrow,BM）移植入WT与YAP-CKO小鼠中,骨髓移植5周后,检测移植过的BMT-WT与BMT-YAP-CKO小鼠的骨髓移植效率。骨髓移植6周后,BMT-WT与BMT-YAP-CKO小鼠腹腔注射5 mg/kg LPS,比较BAL中总细胞和中性粒细胞数量,并检测小鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的含量以及通过伊文思蓝实验对小鼠肺组织的通透性进行检测比较。应用小鼠活体成像系统,将血管中的中性粒细胞用抗体647-Ly-6G标记,检测WT与YAP-CKO小鼠中性粒细胞在提睾肌血管内的滚动和黏附于血管内皮细胞表面的数量。除此之外分离WT与YAP-CKO小鼠的提睾肌和肺组织,应用免疫荧光的方法检测小鼠提睾肌和肺血管内皮细胞表面黏附分子ICAM-1和E-selectin的表达。因而不影响非内皮细胞中YAP的表达,且敲除效率达到95%以上。（2）YAP-CKO小鼠肺组织中YAP的表达降低了60%。（3）内皮细胞YAP敲除不影响小鼠的繁殖情况,子代出生概率遵循孟德尔定律,且小鼠的寿命也不受影响。（4）内皮细胞YAP缺失不影响小鼠的体重和器官大小,只有YAP-CKO小鼠的脾脏脏器系数略高于WT小鼠,其他组织器官未见差异。（5）内皮细胞YAP缺失可以引起基础状态下小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞含量的升高。（6）LPS诱导的小鼠脓毒症模型中,YAP-CKO小鼠肺泡灌洗液中总细胞数和中性粒细胞在LPS未刺激和刺激组中都显著高于WT小鼠。（7）YAP-CKO小鼠肺内皮细胞表面黏附因子ICAM-1和E-selectin的表达在基础状态和LPS刺激下都显著高于WT小鼠。（8）LPS刺激小鼠24小时后,YAP-CKO小鼠肺泡萎陷,中性粒细胞浸润即肺组织出血的程度较WT小鼠相比明显加重,肺组织评分也显著高于WT小鼠。（9）腹腔注射LPS 24小时后,YAP-CKO小鼠肺组织通透性较WT小鼠相比明显增高。（10）LPS刺激6和24小时后,YAP-CKO小鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的含量明显高于WT小鼠。（11）致死剂量LPS刺激下,YAP-CKO小鼠显示出了更快、更高的死亡率。（12）在CLP模型中,YAP-CKO小鼠的平均动脉压和左心室射血分数、缩短时间都显著低于WT小鼠。（13）BMT小鼠骨髓移植模型建立成功,移植效率达到90%以上。（14）用LPS刺激BMT-WT和BMT-YAP-CKO小鼠发现,骨髓移植成功后,BMT-YAP-CKO小鼠的BAL中细胞总数和中性粒细胞数依然明显高于BMT-WT小鼠,且血清中炎症因子IL-6和TNF-α的含量也明显高于BMT-WT小鼠。另外,LPS刺激24小时后,BMT-YAP-CKO小鼠的肺组织通透性明显高于BMT-WT小鼠。（15）内皮细胞YAP缺失可以引起小鼠在基础状态和LPS刺激下提睾肌血管内中性粒细胞的滚动速度减慢且中性粒细胞在血管内皮表面的黏附数量显著增加。（16）敲除内皮细胞中YAP基因,YAP-CKO小鼠提睾肌血管内皮细胞表面黏附因子ICAM-1和E-selectin的表达在基础状态和LPS刺激下都显著高于WT小鼠。结果:（1）YAP-CKO小鼠的构建可以特异性的敲除内皮细胞中YAP的基轻微炎症反应。（2）敲除内皮细胞YAP基因可以显著增加LPS和CLP模型诱导的小鼠炎症反应及心功能衰竭。（3）YAP抑制血管中内皮细胞对PMN的募集。结论:（1）内皮细胞YAP缺失不影响小鼠的生长发育,但会引起肺组织的第三部分YAP对炎症调控作用机制的研究目的:阐明YAP参与炎症调控作用的机制方法:用免疫共沉淀的方法筛选出内皮细胞中内源性的YAP与TLR4信号通路中的蛋白分子是否有相互作用。用细胞免疫荧光的方法检测内皮细胞中内源性YAP与TRAF6在细胞中是否存在共定位。预测YAP与TRAF6之间可能的结合位点,再构建Flag-YAP-WT、Flag-YAP-Mutant（结合位点突变）和Myc-his-TRAF6质粒,共转染进HEK-293T细胞,用免疫共沉淀的方法检测外源性Flag-YAP-WT与Myc-his-TRAF6之间是否有相互作用,再同时检测把结合位点突变后,Flag-YAP-Mutant与Myc-his-TRAF6之间的相互作用是否还存在。用NF-B荧光素酶报告基因检测系统检测Flag-YAP-WT和Flag-YAP-Mutant质粒对TRAF6介导的NF-B活性的影响。用Western Blotting的方法研究整体与离体模型中,内皮细胞敲掉YAP基因后,对LPS诱导的NF-B的活化以及TRAF6蛋白表达的影响。在HEK-293T细胞中共转染Flag-YAP和Myc-his-TRAF6两种质粒,用Western Blotting的方法检测外源性YAP对TRAF6的表达的影响。用免疫共沉淀的方法检测内皮细胞中内源性YAP缺失对内源性TRAF6总泛素化、K48位点和K63位点泛素化的影响。反之,检测外源性YAP过表达对HEK-293T细胞中外源性TRAF6总泛素化、K48位点和K63位点泛素化的影响。用脂质体将TRAF6小干扰RNA（si TRAF6）转入小鼠体内,敲减内皮细胞中TRAF6的含量。用Western Blotting的方法检测si TRAF6在小鼠肺内皮细胞中的干扰效率。小鼠干扰体内TRAF6表达的模型建立成功后,在转染48小时用LPS刺激小鼠,观察并计较si Sc和si TRAF6组中WT与YAP-CKO小鼠对炎症的反应,主要检测指标为BAL中总细胞和中性粒细胞数量以及血清中IL-6和TNF-α炎症因子释放的含量。结果:（1）YAP与TRAF6之间存在相互作用。（2）细胞免疫荧光实验同样也证实了YAP与TRAF6在内皮细胞中有共定位。（3）YAP与TRAF6之间有直接的结合作用,且结合位点在YAP的PDZ-BM结构域（site:471-MPSLQEALSS）。（4）外源性的Flag-YAP-WT可以与Myc-his-TRAF6在HEK-293T细胞中直接相互作用,而Flag-YAP-Mutant与Myc-his-TRAF6之间却不存在这种相互作用。（5）Flag-YAP-WT可以显著的剂量依赖性地抑制TRAF6介导的NF-B的激活,而Flag-YAP-Mutant却不能抑制TRAF6介导的NF-B的活性。（6）小鼠内皮细胞YAP缺失后,会引起NF-B在基础状态和LPS刺激下的显著激活。（7）内皮细胞YAP缺失可以引起基础状态和LPS刺激后TRAF6表达的升高。（8）HEK-293T细胞中,外源性的Flag-YAP可以剂量依赖地抑制Myc-his-TRAF6的表达。（9）内皮细胞YAP敲除可以降低TRAF6总泛素化的发生,同时降低K48位点的泛素化而增加K63位点的泛素化。（10）HEK-293T细胞中外源性过表达YAP可以增加TRAF6总的泛素化,增加其K48位点的泛素化而降低K63位点的泛素化。当K48和K63的泛素化位点发生突变,无论YAP是否表达都会抑制TRAF6在这两个位点泛素化的发生。（11）同过脂质体将si TRAF6转入小鼠体内可以显著抑制TRAF6的表达,干扰效率达到90%。（12）在小鼠体内干扰TRAF6的表达,显著抑制LPS诱导的WT与YAP-CKO小鼠BAL中细胞总数和中性粒细胞的增多,以及小鼠血清中炎症因子IL-6和TNF-α释放水平的增加,且在WT与YAP-CKO小鼠之间比较,上述指标在si TRAF6组没有显著性差别。结论:（1）YAP通过与TRAF6之间的直接相互作用抑制NF-B信号通路的激活。（2）YAP通过对TRAF6泛素化的调节来影响机体的炎症反应。（3）小鼠体内干扰TRAF6的表达可以逆转由于内皮细胞中YAP的敲除所导致LPS诱导的高炎症反应。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1.发现炎症介质所诱导的内皮细胞激活与YAP表达的相关性研究发现不同的炎症介质所诱导的内皮细胞的活化均可以改变YAP的表达含量;应用CRISPR/Cas9技术敲除内皮细胞中YAP基因,可以显著增加内皮细胞活化所释放的细胞因子的含量,并且通过增加内皮细胞表面黏附因子的表达而将更多的PMN募集到内皮细胞表面并发生迁移,为靶向研究通过内皮细胞的活化而影响血管炎症的发生积累了学术基础。2.揭示YAP在内皮细胞的活化和血管炎症的发生发展中发挥重要作用研究从整体动物和细胞分子水平表明内皮细胞YAP缺失可以显著增加内皮细胞的活化,促进内皮细胞分泌炎症因子和增加细胞粘附因子的表达,加剧炎症反应的发生。在LPS致死剂量刺激下,YAP-CKO小鼠显示了在更短的时间内发生了更高的死亡率,揭示了YAP在脓毒症中的重要作用,为寻找靶向血管炎症的药物在脓毒症治疗中的研究提供了实验基础。3.阐明YAP依赖的炎症信号通过调节TRAF6的泛素化而影响NF-B的激活研究进一步阐明内皮细胞中YAP缺失,可以上调TRAF6的表达,阻止TRAF6在K48位点发生泛素化而导致其降解,并促进TRAF6在K63位点发生泛素化而激活TAK1和NF-B通路。这表明了YAP可以调控内皮细胞的活化并通过抑制TRAF6介导的NF-B的激活来阻止机体发生高反应炎症。这为临床中对脓毒症病人的治疗提供了新的靶标和策略。