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研究背景:肝细胞癌(HCC)是我国第四位常见恶性肿瘤,同时也是第二位肿瘤致死病因,这使得其成为全世界最六常见的恶性肿瘤。由于HCC具有较高的侵袭转移的特性及复发率高,患者预后较差。因此,寻找新的HCC治疗靶点具有重要意义。近来研究表明,GP73在HCC的发生发展过程中是一种促癌性调控因素,其过表达可促进HCC细胞的生长、侵袭及迁移。此外,MicroRNAs(miRNAs)靶向调节下游基因与抑制肝癌侵袭转移密切相关。因此,miRNAs靶向调节GP73成为干预HCC侵袭转移的新策略。目的:1.通过收集相关研究资料客观评价中国人群的GP73表达水平与HCC侵袭性及术后转移复发的关系。2.筛选到能够直接靶向调控GP73基因的hsa-miR-141-3p;3.探讨HCC组织中GP73与miR-141-3p表达水平的相关性;4.探讨miR-141-3p靶向调控GP73对HCC细胞增殖、侵袭及转移的影响及分子机制。方法:1.中国人群的GP73表达水平与HCC侵袭性及术后转移复发的关系的评估。(1)采用计算机信息检索系统搜索常用权威英文数据库,包括Embase,PubMed,Web of Science 及 Cochrane 等数据库;(2)我们对包括]]87例患者数据信息的8个独立研究进行了系统评价,评价指标中包含:总生存时间(overall survival,OS)、无病生存时间(disease-free survival,DFS)、血管侵犯、病理Edmondson-Steiner分级及临床TNM分期等相关的临床病理特征;(3)风险比(Hazard ratios,HR)和比值比(Odds ratio,OR)及相应 95%(confidence intervals,CI)的统计采用随机效应模型,并分别作为生存分析结果和临床病理参数的合并统计量。2.筛选到能够直接靶向调控GP73基因的hsa-miR-141-3p。(1)通过生物信息学软件(TargetScanHuman 7.1、microRNA.org 及 MIRDB)筛选到可能直接靶向调控GP73基因的hsa-miR-141-3p;(2)Q-PCR分别检测不同HCC细胞系中hsa-miR-141-3p的表达情况;(3)双荧光素酶报告基因实验验证hsa-miR-141-3p与GP73存在靶向关系。3.HCC组织中GP73与miR-141-3p表达水平的相关性。(1)Q-PCR及Western Blot对癌及癌旁组织中的hsa-miR-141-3p与GP73表达水平分别进行了检测;(2)进行皮尔逊相关系数及与相关临床病理特征及参数相关性的分析。4.miR-141-3p靶向调控GP73对HCC细胞增殖、侵袭及转移的影响及分子机制。(1)MTT、EdU及克隆形成实验,Transwell、细胞划痕愈合实验观察miR-141-3p过表达对HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响;(2)Western blot 检测 EMT 标志物分子的变化,包括 E-cadherin,N-cadherin,occludin,vimentin 及 Cytokeratin 18 蛋白表达水平;(3)功能恢复实验:恢复表达不含3’-UTR的GP73基因后观察miR-141-3p过表达对HCC细胞增殖、迁移/侵袭能力及EMT的影响;(4)体内实验检测miR-141-3p过表达对裸鼠皮下成瘤和体内肺转移能力的影响。结果.:1.HCC 患者 GP73 高表达与更差的 OS[HR 1.958,95%CI 1.548t02.368,12=0.0%]及更差的 DFS[HR 1.775,95%CI 1.416 to 2.133,I2=0.0%]相关;2.HCC患者GP73高表达与肿瘤血管侵犯[OR].286,95%CI 0.618 to 2.679,I2=82.7%],更晚的临床 TNM 分期[OR 10.084,95%CI I.884 to 53.976,I2=93.0%],更差的病理 Edmondson-Steiner 分级[OR 7.912,95%CI 5.492 to 11.399,I2=26.0%]相关;3.通过生物信息学工具预测,可能直接靶向调控GP73基因的hsa-miR-141-3p;hsa-miR-141-3p在HCC细胞系中的表达水平明显低于永生化正常肝细胞系L02;双荧光素酶报告分析表明,hsa-miR-141-3p mimic与GP73-WT-3’UTR质粒共转染可使荧光素酶活性明显下降,而hsa-miR-141-3p mimic与GP73-MT-3’UTR质粒共转染后活性无明显改变;hsa-miR-141-3p在HCC组织中的表达水平明显低于癌旁组织,GP73则相反;与临床病理特征或参数相关性分析表明,hsa-miR-141-3p低表达与与TNM临床分期、肿瘤分化及血管侵犯密切相关;4.MTT、EdU、克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验结果显示,过表达miR-141-3p能够显著抑制HCC细胞增殖能力、克隆形成能力及裸鼠皮下成瘤能力。Transwell、细胞划痕愈合及裸鼠体内肺转移实验结果显示,过表达miR-141-3p能够显著抑制HCC细胞侵袭、迁移及肺转移能力。功能恢复实验显示,恢复表达不含3’-UTR的GP73基因后部分逆转了 miR-141-3p的抑制作用;5.Westernblot检测EMT相关标志物分子显示,在MHCC-97H细胞中过表达miR-141-3p 后,上皮样细胞分子 E-cadherin,occludin,及 Cytokeratin 18 蛋白相对表达水平升高,而间质样细胞分子N-cadherin及Vimentin蛋白相对表达水平则下降,这提示,过表达miR-141-3p能够抑制HCC细胞的EMT过程。功能恢复实验显示,恢复表达不含3’-UTR的GP73基因后部分逆转了 miR-141-3p的抑制作用。结论:1.GP73过表达与HCC患者肝癌切除术后预后不良相关,并对HCC侵袭、转移及复发具有预测价值;2.hsa-miR-141-3p可直接靶向调控GP73基因;临床病理相关资料进一步证实,hsa-miR-141-3p在HCC组织中低表达,其表达水平与GP73 mRNA表达水平呈负相关,并且与HCC侵袭、转移密切相关;3.miR-141-3p作为抑癌基因,通过靶向调控GP73逆转上皮间质转化(EMT)进而抑制肝癌肿瘤的发展和转移。因此,miR-141-3p可能成为HCC治疗的新靶点。