第一部分LncRNA SNHG6在食管鳞癌中的表达及对细胞恶性生物学行为的影响目的:检测长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）核仁小分子RNA宿主基因6（small nuclear RNA host gene 6,SNHG6）在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织及细胞中的表达,探究其对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:1. 收集2019年2月至2019年9月在河北医科大学第四医院接受手术的36例患者的ESCC组织和癌旁组织标本。所有ESCC患者术前均未接受过放疗,化疗和免疫治疗等抗肿瘤治疗,术后均经病理检查确诊。手术标本立即移至液氮罐中保存以提取RNA。所有患者在手术前均签署知情同意书。2.采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测36例患者食管鳞癌组织及对应的癌旁组织中SNHG6的表达水平。3.采用定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）法检测食管鳞癌细胞系（TE1,Yes-2,EC9706和Kyse150）中SNHG6的表达水平,筛选SNHG6表达较高的细胞进行后续功能实验。4.采用脂质体转染方法,通过Lipofectamine ^TM2000向食管鳞癌TE1和EC9706细胞中转染SNHG6小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,构建SNHG6低表达的食管鳞癌细胞系（分别为si-SNHG6-1、si-SNHG6-2、si-SNHG6-3）,转染siRNA-NC作为对照组（Control）,采用qRT-PCR法检测转染效率,选取转染效率最高的两条敲低序列进行后续实验。5.采用集落形成实验、划痕实验、Transwell侵袭实验分别检测SNHG6敲低前后对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:1. qRT-PCR结果显示,SNHG6在ESCC组织中呈高表达状态（P<0.05）,提示lncRNA SNHG6可能与食管鳞癌恶性生物学行为有关。2. SNHG6在食管鳞状细胞癌TE1、Yes-2、EC9706和Kyse150细胞系中均呈高表达状态,选择TE1和EC9706两种细胞系进行后续深入研究。3.qRT-PCR结果显示,敲低SNHG6后,si-SNHG6-1、si-SNHG6-2、si-SNHG6-3组SNHG6表达水平较Control组显著降低（P<0.05）,提示SNHG6低表达食管鳞癌细胞系构建成功,且在三组敲低序列中,si-SNHG6-1、si-SNHG6-2两组敲低效率较高。4.集落形成实验结果显示,与Control组相比,si-SNHG6-1、si-SNHG6-2组食管鳞癌TE1和EC9706细胞的增殖能力显著降低（P<0.01）。5.划痕实验结果显示,与Control组相比,si-SNHG6-1、si-SNHG6-2组食管鳞癌TE1和EC9706细胞的迁移能力显著降低（P<0.05）。6.Transwell侵袭实验结果显示,与Control组相比,si-SNHG6-1、si-SNHG6-2组食管鳞癌TE1和EC9706细胞的侵袭能力显著降低（P<0.01）。结论:1.lncRNA SNHG6在食管鳞癌组织中呈高表达状态。2.lncRNA SNHG6促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。第二部分SNHG6/miR-101-3p通过上调ZEB1表达促进食管鳞癌上皮间质转化目的:软件预测lncRNA SNHG6作用的下游靶基因和靶蛋白,应用分子生物学实验分析SNHG6与下游靶基因和靶蛋白的作用关系及其生物学功能,探讨SNHG6影响ESCC上皮间质转化的机制。方法:1.采用生物信息学软件预测lncRNA SNHG6靶micro RNA（miRNA）。2.采用质粒转染方法,通过Lipofectamine ^TM2000转染处理293T细胞,分为SNHG6-WT+miR-NC、SNHG6-WT+miR-101-3p mimic、SNHG6-MUT+miR-101-3p mimic、SNHG6-MUT+miR-NC四组,采用双荧光素酶报告基因检测和qRT-PCR法初步验证SNHG6与miR-101-3p的相关性。3. 采用qRT-PCR法检测36例食管鳞癌组织及对应的癌旁组织中miR-101-3p的表达。4. 采用质粒转染方法,通过Lipofectamine ^TM2000在食管鳞癌TE1和EC9706细胞中转染miR-101-3p mimic,构建过表达miR-101-3p的ESCC细胞系,同时转染miR-NC作为阴性对照组,采用qRT-PCR法检测转染效率。5. 采用集落形成实验、划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测miR-101-3p过表达前后对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;6.采用生物信息学软件预测miR-101-3p靶基因。7.采用质粒转染方法,通过Lipofectamine ^TM2000转染处理293T细胞,分为miR-NC+ZEB1-WT、miR-101-3p mimic+ZEB1-WT、miR-101-3p mimic+ZEB1-MUT、miR-NC+ZEB1-MUT四组,采用双荧光素酶报告基因检测和qRT-PCR法初步验证SNHG6与ZEB1的相关性。8.采用脂质体转染方法,体外通过Lipofectamine ^TM2000转染分别处理食管鳞癌TE1和EC9706细胞,将两种ESCC细胞各分为SNHG6敲低对照组（si-NC）、SNHG6敲低组（si-SNHG6）、SNHG6敲低和miR-101-3p敲低对照组（si-SNHG6+miR-NC inhibitor）、SNHG6和miR-101-3p同时敲低组（si-SNHG6+miR-101-3p inhibitor）、SNHG6敲低对照和miR-101-3p过表达对照组（si-NC+miR-NC mimic）、SNHG6敲低对照和miR-101-3p过表达组（si-NC+miR-101-3p mimic）,采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测各组细胞的ZEB1和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Twist、Snail）表达水平。结果:1.生物信息学软件预测结果显示,lncRNA SNHG6与miR-101-3p有特异性结合位点,说明miR-101-3p可能是SNHG6的靶miRNA。双荧光素酶报告基因检测结果显示与SNHG6-WT、miR-101-3p mimic+SNHG6-MUT、miR-NC+SNHG6-MUT三组相比,miR-101-3p mimic+SNHG6-WT组荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,而miR-NC+SNHG6-WT、miR-101-3p mimic+SNHG6-MUT、miR-NC+SNHG6-MUT三组间荧光素酶活性无统计学差异（P>0.05）。qRT-PCR结果显示,si-SNHG6-1、si-SNHG6-2组食管鳞癌细胞的miR-101-3p表达显著高于Control组（P<0.05）,说明miR-101-3p是SNHG6的靶miRNA,且两者的表达呈负相关。2.qRT-PCR结果显示,miR-101-3p在食管鳞癌组织中的表达显著低于癌旁组织（P<0.05）。提示miR-101-3p可能作为抑癌基因参与ESCC的发生发展。3.qRT-PCR结果显示,miR-101-3p mimic组食管鳞癌细胞的miR-101-3p表达显著高于miR-NC组（P<0.05）,提示过表达miR-101-3p的食管鳞癌细胞系构建成功。4.集落形成实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-101-3p mimic组食管鳞癌细胞的增殖能力显著降低（P<0.01）。5. 划痕实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-101-3p mimic组食管鳞癌细胞的迁移能力显著降低（P<0.05）。6. Transwell侵袭实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-101-3p mimic组食管鳞癌细胞的侵袭能力显著降低（P<0.01）。7. 生物信息学软件预测结果显示,miR-101-3p与ZEB1有特异性结合位点,说明锌指蛋白E-盒结合同源异形盒-1（Zinc finger E-box binding homeobox factor 1,ZEB1）可能是miR-101-3p的靶m RNA。双荧光素酶报告基因检测结果显示,与miR-NC+ZEB1-WT、miR-101-3p mimic+ZEB1-MUT、miR-NC+ZEB1-MUT三组相比,miR-101-3p mimic+ZEB1-WT组的荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,但miR-NC+ZEB1-WT、miR-101-3p mimic+ZEB1-MUT、miR-NC+ZEB1-MUT三组间的荧光素酶活性无统计学差异（P>0.05）。qRT-PCR结果显示,miR-101-3p mimic组食管鳞癌细胞的ZEB1表达显著低于miR-NC组（P<0.05）,说明ZEB1是miR-101-3p的靶基因,且两者的表达呈负相关。8. Western blot结果显示,与si-NC组相比,si-SNHG6组ZEB1表达显著降低,EMT相关蛋白E-钙粘蛋白（E-cadherin）表达升高,N-钙粘蛋白（N-cadherin）、Snail、Twist表达降低（均P<0.05）;与si-NC+miR-NC mimic组相比,si-NC+miR-101-3p mimic组的ZEB1表达显著降低,E-cadherin表达升高,N-cadherin、Snail、Twist表达降低（均P<0.05）;与si-SNHG6+miR-NC inhibitor相比,si-SNHG6+miR-101-3p inhibitor组ZEB1表达显著升高,E-cadherin表达降低,N-cadherin、Snail、Twist表达升高（均P<0.05）。说明敲低miR-101-3p的表达可以拯救由SNHG6敲低引起的ZEB1下调和EMT的逆转。以上结果说明lncRNA SNHG6通过SNHG6/miR-101-3p轴上调ZEB1的表达,诱导ESCC上皮间质转化,从而作为促癌基因参与ESCC的发生发展。结论:LncRNA SNHG6通过miR-101-3p/ZEB1轴促进ESCC的EMT进程。第三部分SNHG6/miR-101-3p/ZEB1轴影响食管鳞癌发生发展的体内实验研究目的:探索SNHG6/miR-101-3p/ZEB1轴在裸鼠体内的致癌作用,为ESCC的逆转治疗奠定理论基础。方法:1.构建稳定低表达lncRNA SNHG6的EC9706细胞系。2.将sh-SNHG6和sh-NC两组细胞悬液皮下注射至4周龄雌性BALB/c裸鼠的腹股沟处,构建裸鼠移植瘤模型。3.每3天对裸鼠进行称重;每1周用游标卡尺体外测量裸鼠移植瘤肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线;3周后,通过颈脱位法处死所有裸鼠,取出原发肿瘤并称重。4.采用qRT-PCR法检测小鼠移植瘤组织中SNHG6和miR-101-3p的表达水平。5.采用Western blot法检测小鼠移植瘤组织中ZEB1和EMT相关蛋白的表达水平。结果:1.肿瘤生长曲线显示,sh-SNHG6组移植瘤生长速度明显低于sh-NC组（P<0.01）。取出移植瘤后称重,sh-SNHG6组的肿瘤大小、重量明显小于sh-NC组（P<0.05）。说明敲低SNHG6表达可明显抑制裸鼠体内移植瘤的生长,有抗肿瘤效应。2.qRT-PCR结果显示,sh-SNHG6组SNHG6的表达显著低于sh-NC组（P<0.05）,而sh-SNHG6组miR-101-3p的表达显著高于sh-NC组（P<0.05）。说明在裸鼠体内敲低SNHG6可以显著升高miR-101-3p的表达。3.Western blot结果显示,与sh-NC组相比,sh-SNHG6组的ZEB1表达降低,E-cadherin表达升高,N-cadherin、Snail、Twist表达降低（均P<0.05）。说明敲低SNHG6表达可以显著抑制体内移植瘤中ZEB1的表达,逆转EMT转化。结论:1.敲低lncRNA SNHG6表达显著抑制移植瘤的生长。2.LncRNA SNHG6通过miR-101-3p/ZEB1轴在裸鼠体内发挥致癌作用,诱导EMT发生,促进食管鳞癌发生发展。