1.肌萎缩侧索硬化症的临床特征肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一种成年起病的慢性退行性病变，以皮层、脑干及脊髓的运动神经元逐渐死亡为特征。ALS患者的上、下运动神经元同时受累，一般不影响感觉系统，智能和认知一般不受侵犯。运动皮层的运动神经元变性引起临床可见的上运动神经元损害体征，如Hoffmann征，Babinski征，阵挛，脑干、脊髓的下运动神经元损害可引起肌萎缩、纤颤。患者表现为进行性的肌肉无力、萎缩，肌肉跳动和腱反射亢进、病理反射阳性。本病以男性多见，男：女比例约为1.5-2：1，西方报道平均发病年龄55-58岁，通常在首发症状出现后3-5年死于呼吸肌麻痹。年龄调整后世界范围内的发病率是0.5-3/10万人，患病率是4-6/10万人。 2.ALS定位研究现状及存在的问题尽管进行了大量的研究，ALS的病因至今不明。虽然大多数的病例是散发的(SALS)，大约10％的ALS病例是家族性的(FALS)。在约20％的FALS病例中，已证实铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因突变是明确的病因，其余80％的FALS病例的病因有待于发现。 材料和方法 1.实验材料 家族性肌萎缩侧索硬化症(FALS)家系该FALS家系来于广东省南海县。它包括6代计237人(见图1)。从患病家系成员的临床表现来看，本组病例绝大多数于50岁前出现肌肉萎缩、无力，发病后进展快，肌肉萎缩、无力持续6个月到2年，个别达到3年。 在临床表现上，该组病例以肌束颤动、肌肉萎缩、腱反射亢进及晚期球麻痹为特点，符合ALS的临床表现，EMG显示典型运动神经元损害特点，未见传导速度改变及传导阻滞等，达到ALS的诊断标准。共13人诊断为患者，包括明确死于该病的7个该家系成员和另外6个表现了肌肉萎缩、无力及EMG显示确切运动神经元损害的6人。由于连锁分析需要根据完整家系资料的资料送行分析的本质决定，我们尽可能从所有签署知情同意书的该家系成员中搜集到血标本并纳入家系分析。但在具体的工作中，为了使分析工作更简洁、明了，我们将家系中的所有的患病成员纳入，如果某患病家系成员己死亡，则纳入他(或她)的配偶、子女、同胞等以帮助重建其单倍型，如果某一该家系成员及他(或她)的以下两代均无成员患病，则将其剔出分析，从而构成我们的核心分析家系，共59人。 2.方法 2.1收集家系资料及血标本采集我们与该家系研究的联系人员，也是发现并推荐该家系的医疗人员进行联系，在得到该家系的家庭成员同意后，由两个医生、两个助手组成的医疗小组与该家系成员接触，得到知情同意书后，采集血标本、记录病史、查体并有一个初步的诊断意向。 诊断标准明确死于该病；或具：明确的至少一个区域(延髓、颈髓、胸髓、腰骶髓)具有上、下运动神经损害的体症。肌电图显示提示神经原性损害，并有高波幅、宽时限的运动电位，运动和感觉传导速度正常，但远端运动传导的潜伏期可延长，没有传导阻滞。无感觉障碍体征、扩约肌功能障碍、视觉障碍、明显植物神经功能障碍、帕金森病样锥体外系体征，Alzheimer病，排除其它可引起该表现的神经科情况，如颈准病等。 2.2基因组扫描根据尽可能获得最多的遗传信息并重建死亡患者的单倍体型的原则，我们从所获得的47份血标本中选出24份进行基因组扫描。基因组扫描是通过使用多态标记引物对选定的24份血标本进行PCR扩增，分离产物，分析所得的图象，将数据存入数据库，计算两点LOD值，必要时计算多点LOD值，对感兴趣的区域进一步增加多态标记密集扫描并进一步分析，重建单倍体型。 2.2.1选择进行基因组扫描的多态标记从CooperativeHumanLinkageCenterHumanScreeningSetWeberversion8and8A(建立在欧洲资料的基础上)，首先选出约350个多态标记，它们覆盖22条常染色体，各多态标记之间的平均距离为10-14cM。 2.2.2PCR扩增反应我们的所有顺向引物包括向5扩伸的19个碱基，与荧光标记的M13寡核苷酸互补，从而使得在PCR扩增时能在产物中引入荧光物质M13引物添加碱基对顺序：Forward5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’Reverse5’-GGATAACAATTTCACACAGG-3’ 2.2.3PCR扩增条件DNA2μl(7.5μg/ml)，引物0.1μl(20μM)，RG251μl(或RG15，RG20，RG30)，dNTP2μl(100μM)，Taq0.1μl(5000U/ml)，700或800荧光标记0.2μ1，双蒸水4.6μl，总容量为10μl。 反应条件：初始变性为95℃5分钟，接着30个循环，每个循环包括：58℃1分钟，51-61℃(取决于不同的多态标记，以53℃最常用)1分钟2秒，72℃1分钟，最后在72℃延伸6分钟。 2.2.4PCR产物分离PCR后，我们将PCR产物与2μl的加样反应物混合，95℃加热1分30秒钟变性，加样入48孔梳，在6％的多聚丙烯酰胺凝胶上走样。经过2-3小时，DNA片段就分离开来。使用377DNA测序仪走样，GeneScan软件进行采样。 2.2.5图象分析使用半自动的RFLP软件进行图象分析，它能自动测量PCR产物分离得到的等位基因产物具体的碱基对大小，并将其按大小顺序分配数值。 2.3连锁分析2.3.1LOD值计算软件包LINKAGE(FASTLINK，version4.0，NationalCenterforBiotechnologyinformation)的MLINK被用来计算疾病与多态标记之间的两点及多点LOD值[1-3]。假定该家系为常染色体显性遗传方式，标准的ALS外显率，各多态标记等位基因频率估计为相等，ALS疾病频率为0.001。 2.3.2单倍体重建使用Cynllic(version2.1；CherwellScientific，Palo，Calif)软件来显示家系图(包括单倍体型)。当LOD值大于0.8时，我们对此进行进一步的分析。使用SLINK及MonteCarlo模拟(20000次)计算获得该LOD值的对应的P值。单倍体型用人工重建，并与SIMWALKv2.82(Weeks，1995)软件重建的单倍体型进行比较。 2.4突变检测感兴趣区域的候选基因的选择是建立在我们现有的对ALS运动神经元选择性死亡的理解及认为基因产物很可能分布在脑及运动神经元的基础上。DNA扩增及测序使用的寡核苷酸引物是使用(Primer3WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch)设计的，引物的特异性是根据BLAST搜索已知的人类DNA顺序证实。荧光染色测序是使用标准的方案，通过自动测序仪(BeckmanCoulter.Inc，2002)收集测序结果，并使用Sequencer(1991-1999，GeneCodeCorporation)分析。 结果 1家族性肌萎缩侧索硬化症(FALS)家系临床及血标本收集情况该FALS家系来于广东省南海县。它包括6代：第一代2人，第二代10人，第三代32人，第四代79人，第五代103人，第六带11人，共计237人(见图1)。其中，前三代均已死亡，无资料记载(第三代死于该病患者的情况均有至少两个以上直系亲属回忆、证实)。 2基因组扫描：LOD值计算基因组扫描得到了15个大于0.8的两点LOD值，多态标记D1S16i2在θ=0.1给予我们最大的两点LOD值1.84(见表1)，当使用更多的多态标记对该两区域进行密集扫描时，D1S2870给予两点LOD值2.22(见表2)，多点LOD值计算显示疾病位点位于D1S2870和D1S1612之间，得到了最大的三点LOD值4.14(见图8)，这是非常有意义的。 3连锁分析：单倍体型重建1号染色体上的该候选区域的重组分析显示有一个染色体片段可能与疾病相连锁。所有明确的在标准下认为患病的个体均携带有该单倍体型，部分未患病个体亦带有该单倍体型，这很可能反应了不完全或年龄依赖的外显率。 4基因突变的检测1p36该候选区域，具体说来是1p36.32-1p36.21之间，共包含了大约129个基因(见图12，13，NCBIHomosapiensmapviewer)。建立在我们目前对ALS患者运动神经元选择性死亡的理解及假定候选基因产物很可能分布在脑或运动神经元的基础上，我们首先选择了三个可能的候选基因KIF1B，KCNAB2和DJ-1进行测序。 结论 1.完成了对一个排除SOD1基因突变的6代、共计237人的常染色体显性遗传、成年起病的大的FALS家系的410个微卫星多态标记基因组扫描。 2.基因组扫描多态标记D1S2870在θ=O给予我们最大的两点LOD值2.22，当使用更多的多态标记对该两区域进行密集扫描、多点LOD值计算及单倍体分析时，在疾病位点位于D1S2870和D1S1612之间时，得到了最大的三点LOD值4.14。 3.该候选区域包括129个基因，已完成三个候选基因的测序(69个外显子)，在所测的外显子，尚未发现突变。 创新点 1.国内首次对一个FALS家系进行微卫星多态标记基因组扫描及连锁分析。 2.将一个大家系的基因定位于1p36，为克隆该基因打下良好的基础。