结核病是一种全球性的、人畜共患传染病,是严重危害养殖业和人类健康的重大疫病之一。由于没有有效的预防和根除方法,目前主要采用检疫-扑杀结合的方法。结核病的发生与机体的抗病力密切相关,因而,如何提高机体的抗结核能力一直是人们关注的焦点。近年来,病原-宿主相关作用机制研究的深入、基因编辑技术和动物克隆技术的快速发展,使抗结核牛羊的培育和生产成为可能。研究显示,机体对结核分支杆菌的抵抗力强弱与天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的表达存在量依赖性关系。因此通过转基因手段来增强牛Nramp1基因表达,培育抗病种群,可成为控制牛结核病的一个新切入点。本研究分别克隆了秦川牛Nramp1开放阅读框及荷斯坦奶牛Nramp1基因启动子区(5’侧翼区-1483~+73)序列,构建了牛Nramp1吞噬细胞特异性真核表达载体,转染荷斯坦奶牛新生牛成纤维细胞,筛选阳性克隆作为核移植供体细胞,生产培育转Nramp1基因克隆牛,取得以下结果:1.基因克隆、载体构建与功能验证。以秦川牛外周血总RNA为模板PCR扩增Nramp1基因开放阅读框,获得的序列对比Gen Bank中的牛的相应的基因序列(Gen Bank序列号U12862.1),发现存在2个碱基差异:第1个差异碱基致使基因编码的第49个氨基酸发生变化使苏氨酸(ACA)转变为丙氨酸(GCA);第2个差异碱基并未引起其编码氨基酸的差异,即第53位氨基酸均为精氨酸(AGG→CGG)。荷斯坦奶牛Nramp1基因5’侧翼区(-1483~+73)序列在巨噬细胞内有启动子活性,且H37Ra可以诱导调节该区段的启动子活性。使用牛Nramp1基因5’侧翼区(-1483~+73)序列调控Nramp1基因表达,构建了牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体p Lox P-2A-N。载体p Lox P-2A-N中使用FMDV 2A自剪肽连接GFP与Neo基因,并在细胞筛选标记基因两侧添加同向的Lox P位点。将该片段分别转入E.coli BM25.8菌株和HEK293,经菌体Cre酶及Cre酶细胞共孵育实验均证明在Cre酶的作用下,Lox P可有效去除中间的筛选标记基因,但序列中会残存一个Lox P位点。2.转基因细胞株的筛选与鉴定。线性化载体p Lox P-2A-N转染奶牛成纤维细胞获得转Nramp1基因细胞株D4、E3。Q-PCR鉴定2株细胞外源基因拷贝数为1。染色体步移试验检测出D4株外源基因插入第29号染色体、E3外源基因插入第10号染色体,两细胞株外源基因插入位点均位于基因组非编码区内。细胞核型试验证明2株细胞染色体数目均为60条。3.核移植与转基因牛生产、鉴定。以D4、E3作为核移植供体细胞生产的转Nramp1基因重构胚胎体外及体内发育率正常,获得3头犊牛(大于2月龄)经PCR与Soutern Blot鉴定均为转Nramp1基因克隆牛。Q-PCR分析外源基因插入没有影响其插入位点上下游基因m RNA的表达水平。分离转基因牛与非转基因牛(供体细胞来源)外周血单核细胞诱导为巨噬细胞。结核分支杆菌H37Ra侵染牛MDMs。正常培养条件下,转基因牛MDMs Nramp1基因表达量与非转基因牛差异不显著;攻菌后,转基因牛MDMs Nramp1基因表达量显著高于非转基因牛。攻菌3 d后,转基因牛MDMs细胞荷菌数显著低于非转基因牛。说明秦川牛Nramp1基因的转入增强了荷斯坦奶牛MDMs对结分支核菌的抑制与杀伤作用,即转入Nramp1增强了牛对结核分支杆菌的抵抗能力。4.SCNT胚胎早期发育阶段体外培养体系的确立。通过SCNT检测胚胎发育率、囊胚细胞总数、ROS水平、囊胚细胞凋亡率和ICM比例指出牛SCNT胚胎体外培养全程添加Vit-C可以提高胚胎卵裂率但降低囊胚孵化率,降低了胚胎质量与发育能力。在转基因牛培育过程中不适宜使用Vit-C作为添加剂。综上所述,本研究获得3头转Nramp1基因克隆牛,完善了转基因牛生产技术体系。从增强动物体自身天然免疫力角度出发,通过转基因手段培育抗病种群,为牛结核病的防控创造一个新切入点。