论文部分内容阅读
NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）蛋白首先由Kjeldsen等人于1993年在中性粒细胞内发现，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关。我们在运用基因芯片技术筛选永生化食管上皮细胞系SHEE和由SHEE转化而来的食管癌细胞系SHEEC之间的差异表达基因时发现NGAL基因在SHEEC细胞中过表达，进一步研究发现NGAL基因可能与肿瘤的侵袭与转移相关，但确切的功能与机制不清楚。最近我们研究发现NGAL基因还可能参与细胞的分化。越来越多的研究结果提示NGAL可能是一种重要的炎症或肿瘤标志物，对判断与监测病情变化具有重要的意义。但是目前无论是NGAL蛋白本身还是抗NGAL的抗体均未商品化，所以本文通过原核表达的策略首先获得纯的NGAL蛋白、然后制各其抗体，最后通过对各种食管癌组织样品进行检测，探讨NGAL基因在食管癌中的表达模式，这对深入研究NGAL在生理和病理过程中所发挥的功能具有科学意义和应用价值。 主要研究内容和方法： 一、构建四种NGAL原核融合表达载体并比较分析蛋白表达产物。 二、Ni2+-金属鏊合层析技术纯化NGAL蛋白并制备多克隆抗体。 三、研究NGAL基因在食管癌组织及其血浆中的表达模式。 主要的研究结果： 一、构建了NGAL基因四种原核融合表达载体。 二、成功进行了四种NGAL融合蛋白的原核表达，并分析了它们的表达量、可溶性及其细胞定位，最后筛选出了适合大样表达NGAL蛋白的原核融合表达载体pDsbA2.0-NGAL。 三、成功进行了NGAL蛋白的纯化与鉴定，获得了较纯的NGAL蛋白。 四、成功制备出效价高、特异性较好的NGAL多克隆抗体，适用于IHC、Western blotting及ELISA等。 五、运用IHC、Western blotting及ELISA等实验技术，初步探讨了NGAL基因在食管癌组织中的表达模式。汕头大学医学院硕士研究生论文结论及意义:一、不同的融合伴侣对靶蛋白的表达量、细胞定位以及可溶性会产生不同的影 口向。二、NiZ七金属鳌合层析纯化技术是一种高效的纯化蛋白的技术。三、成功建立了检测NGAL表达模式的实验技术:免疫组织化学、western blotting与EL工SA技术，通过不同层面揭示了NGAI砂在食管癌中的表达模式:IHC实验显示染色阳性细胞定位于细胞胞浆且集中于高分化食管鳞状上皮细胞癌癌巢癌珠部分;Western blotting实验结果显示NGAL蛋白在部分食管癌组织中表达上调，但尚需增加样本量进一步确证;而ELISA实验结果初步显示在正常人群血浆/血清中能够检测到NGAL基因的蛋白表达产物，这为进一步探讨NGAL基因在食管癌中的生物学功能与意义奠定了实验基础。