人参皂苷是人参的主要药理活性成分,对心脑血管、神经系统、抗辐射、抗炎、抗肿瘤等作用独特。人参皂苷在天然中含量极低,Compound K甚至在天然中并不存在,由于其复杂的特殊化学结构,目前主要采用温和专一的微生物转化法制备。微生物转化即利用微生物代谢过程中产生的酶系对底物进行催化反应,增加活性产物含量或产生新的结构化合物。因而,在酶的合成及活性水平上对人参皂苷的微生物代谢进行调控研究在理论和工业生产应用上兼具重大意义。本实验室从野山参土壤中分离筛选得到了转化菌株Paecilomyces bainiersp.229,可以将三七茎叶总皂苷(其中,人参皂苷Rbl含量为62.08%)转化为人参皂苷Compound K,转化率达到72.9%,但是存在底物投料浓度偏低的问题,仅为0.5%。为了提高底物投料浓度,将菌种进行了诱变,并以高浓度底物进行筛选,获得了能耐受高浓度底物的突变株sp.229-6和sp.229-7。诱变株sp.229-6的转化终产物依然是Compound K,本研究对sp.229-6转化人参皂苷Rb1的代谢途径及调控因素进行了研究,通过筛选酶诱导剂、改变细胞膜通透性等手段,得到最优发酵条件：种子瓶生长36h,接种,同时添加4%。的吐温80,培养24h之后,加入0.5%o的底物作诱导,继续生长24h,以1.5%或1.0%投料,装液量30m1/250m1摇瓶,28℃,200r·min-1摇床转化72h,控制pH值为5.0。在底物投料浓度为1.5%,最终转化率可达43.63%；投料量为1.0%,最终转化率达到61%。同样发酵体系下,与sp.229相比,sp.229-6转化生产CK总产量可以提升67-80%,具有良好的工业应用价值。突变株sp.229-7的转化产物为单一的Rd,在对其发酵条件优化过程中,我们发现钙离子可以大大促进Rd的生成。因而,本研究以钙信号转导对sp.229-7转化人参皂苷Rbl的影响为切入点进行深入展开,通过添加不同浓度钙离子、添加钙离子信号转导关键蛋白拮抗剂等手段研究钙离子及钙信号转导对人参皂苷微生物转化的影响。结果显示钙离子及钙信号转导对Rd的生成、p-葡萄糖苷酶的活性均有一定程度的促进作用,研究首次揭示了钙离子在人参皂苷微生物转化过程中发挥的调控作用：在sp.229-7转化人参皂苷Rbl生成Rd的过程中,钙离子激发信号传导机制,在45mM胞外钙离子水平下,人参皂苷Rd的产量、β-葡萄糖苷酶活性达到最大。本研究同时初步探索了CaM对p-葡萄糖苷酶基因合成的调节作用及sp.229-7中钙信号转导途径。另外,通过分离纯化发酵液中sp.229-7菌体,得到一个电泳纯的p-葡萄糖苷酶,酶比活力为169.91,酶活回收率为1.42%,蛋白回收率为0.009%,纯化倍数为163.37倍。该酶的最适反应pH为4.0,最适反应温度为55℃,在pH5.0-8.0以及55℃以下,酶较稳定。在一定浓度范围内,钙离子对酶在不同pH和温度下的活性都有一定的激活作用,且增强了酶对温度的稳定性,并在一定范围内(pH<6)也能增加酶对pH的稳定性。