骨骼肌细胞的一个重要特性是其具有的可兴奋性,在神经支配下,骨骼肌细胞能够产生并传导动作电位,通过兴奋收缩耦连机制,最终引发肌肉收缩,产生运动。此收缩运动过程中肌肉所需要的电生理活性主要是由离子通道精细地产生并控制的。离子通道是一种成孔蛋白,这种蛋白能够筛选某种特定类型的离子,并允许其依靠电化学梯度力经过通道转移,从而建立和控制细胞质膜间的微弱电压差发挥作用,如静息膜电位及动作电位的产生等。肌肉运动的电生理活性主要是通过钠通道、钙通道及钾通道产生并维持的。由此可知,当特异性表达于肌肉的离子通道结构或功能出现异常时,可能会导致肌肉运动的异常,从而引起疾病,主要表现为肌肉可兴奋性的改变,而这种病理改变主要是由于编码离子通道的基因异常或基因表达异常而引发的。低钾性周期性麻痹(Hypokalemic periodic paralysis, HypoKPP)是离子通道病的一种,其特点为肌肉的可兴奋性降低,临床表现为反复突发的肌无力,并伴随有明显的血钾水平降低。HypoKPP根据病因可分类为：家族性周期性麻痹(Familial periodic paralysis, FPP)、甲状腺毒性周期性麻痹(Thyrotoxic periodic paralysis, TPP)及散发性周期性麻痹(Sporadic periodic paralysis, SPP)。其中,FPP相关的报道研究较多。FPP为常染色体显性遗传,常见于高加索人群,其致病基因主要为编码骨骼肌电压门控通道α1亚单位的CACNAIS (Calcium voltage-gated channel subunit alphal S)基因以及编码钠通道α亚单位的SCN4A (Sodium voltage-gated channel alpha subunit 4)基因。而TPP与SPP由于较为罕见,到目前为止,其致病基因和发病机制尚不明确,仍有待研究。近年来,TPP与SPP患者数量在亚洲人群,尤其是我国,呈现递增态势,因此,对这两类疾病的临床及致病机制研究对我国相关神经肌肉病有较高的临床指导意义。TPP是甲亢患者的神经肌肉并发症,在甲亢患者中的发病率约占3%-7%,部分甲亢患者的首发表现和就诊原因也可为周期性麻痹。该病在亚洲国家的青年男性多见,特别是在我国的青年男性人群中发病率相对较高。TPP以反复发作的肢体无力或瘫痪为主要临床特征,多发作于清晨。患者可表现为发作性上下肢及躯干的迟缓性瘫痪,同时伴有肌肉电兴奋性和腱反射的消失。TPP患者同时具有甲状腺功能亢进的临床症状和体征,如体重下降、心动过速、甲状腺肿大、震颤及眼征等,可由Graves’病、桥本氏甲状腺炎等引起。TPP发作时,患者的血钾水平可有不同程度的降低,严重时血钾水平可低于2mmol/L,危险性极高。在甲状腺毒症未被控制的情况下,预防性的补钾治疗不能够有效阻止肌无力的发生,但在发作期补钾治疗则具有明显的疗效。SPP患者为散发病例,无家族史且甲状腺功能正常,也主要发生于亚洲的青年男性,且在我国具有相对较高的发病率。临床特征与FPP相似,为反复发作的肢体无力或瘫痪,伴有不同程度的血钾水平降低。常于清晨或下午发病,可由一侧下肢轻度无力逐渐累及至四肢,一般情况下呼吸肌及心肌不受累。多数患者的肌无力症状能自行缓解,但部分可呈进展性发展并致永久性肌肉损害。其发作还与多种诱因有关,如高糖饮食、感冒、久坐或者运动后等。目前,对于缓解SPP发作期的症状,补钾治疗效果较为显著。在本项研究中,我们主要收集山东大学齐鲁医院神经内科及内分泌科前来就诊的TPP和SPP患者病例,总结并探讨其临床特点及相关辅助检查的特异性,为疾病认知及治疗提供理论依据。同时为深入探讨TPP和SPP的发病机制,我们对上述两种疾病进行分子遗传学研究,研究其相关致病基因等,为进一步探索两种疾病的病理发生过程提供颇具意义的研究基础以及新的研究思路。第一部分甲状腺毒性周期性麻痹与散发性周期性麻痹的临床特点分析及KCNJ18基因的突变筛查TPP和SPP的临床表现与FPP极为相似,因此,既往对该两种疾病遗传方面的研究多针对与FPP致病有关的基因。已有研究报道,6.6%的台湾SPP患者与CACNA1S基因突变R669H、R1135H和R1239H相关,1%的中国大陆SPP患者与CACNA1S基因突变R672C相关。而在TPP患者中,仅发现一例与SCN4A基因突变F671S相关。2010年Ryan等首次发现KCNJ18(Potassium voltage-gated channel subfamily J member 18)新基因与TPP相关,该基因编码肌纤维上的内向整流钾通道Kir2.6(Inwardly rectifying potassium channel 2.6)。Kir2.6为Kir2家族的一员,能够在维持钾离子平衡电位和调节细胞兴奋性等方面发挥重要作用。Ryan等研究表明,在高加索TPP患者中,KCNJ18基因突变比例为33%。Cheng等研究发现,在台湾TPP患者中,KCNJ18基因的突变比例仅为1.67%,并首次报道该基因突变与台湾SPP患者相关,比例为3.3%。而在我国南方地区的TPP患者中,KCNJ18基因的突变比例为7%,但我国SPP患者是否与此基因突变具有相关性尚需进一步的研究。此外,相关病例样本数扩大可为其致病性研究提供一定的研究基础。本项研究根据TPP和SPP临床诊断标准为入组条件,选取2010-2013年于山东大学齐鲁医院神经内科和内分泌科就诊的116例患者作为研究对象,其中,TPP患者31例,SPP患者85例；对所有患者均进行详细的临床资料、辅助检查及相关治疗的采集及统计；同时,对所有患者血样均提取DNA并进行KCNJ18基因测序分析。TPP患者均为男性,起病年龄为20至40岁之间,首次发作均表现为四肢瘫痪,93.6%的TPP患者发作时血钾浓度为1.5-2.5 mmol/L,发作时间多为夜间或清晨睡眠醒来时,每次发作时间不超过24小时,其中有25例患者已有2次肌无力发作,6例患者有3次及3次以上发作。每次发作均伴有甲状腺功能亢进。23例TPP患者在首次肌无力发作时才被诊断为患有甲状腺功能亢进症。其中,27例患者被诊断为Grave’s病,4例为亚急性甲状腺炎。所有TPP患者在纠正其甲状腺功能亢进后,肌无力发作得到有效地缓解及预防。同时,在发作期,患者的补钾治疗效果显著。而在收集的SPP患者中,2例为女性患者。SPP起病年龄为16-37岁,68.2%的SPP患者发作时血钾浓度为1.6-2.5 mmol/L,每次发作持续数小时至数天不等,肌无力症状表现不一。其中有10例患者已有2次肌无力发作,75例患者有3次及3次以上发作。SPP在发作期补钾治疗效果明显。KCNJ18基因测序分析结果显示,一例SPP患者的KCNJ18基因3号外显子存在新杂合点突变c.505G>C,由精氨酸代替甘氨酸(p.G169R)。该患者为34岁男性,17岁起病,第一次发作表现为晨起四肢瘫痪,呼吸肌不受累。血钾为1.8mmol/L, CK为1964IU/L,心电图检查无异常。患者未能接受补钾治疗,并在大约24小时后,症状开始缓解。此外,肌电图运动诱发实验(Exercise test, ET)检测结果为,与在静息时测得的结果相比,患者在5分钟持续运动后即刻测得的复合肌肉动作电位(Compound muscle action potential, CMAP)的波幅增长了约21%,而在运动后1小时CMAP的波幅降低了约64%,符合周期性麻痹的诊断。第二部分Kir2.6突变蛋白的功能缺陷验证及其相关致病机制的研究已有报道表明,在中国TPP患者中存在4例KCNJ18基因相关突变,p.Q126X,p.K360T, p.E388K及p.A200P,其中,A200P突变型Kir2.6通道已验证为不具备内向整流钾通道功能,而p.Q126X,p.K360T与p.E388K则为首次报道的新突变,这些突变型通道电生理特性的改变尚需进一步的研究探索。我们的研究发现KCNJ18基因突变同样与SPP致病相关,提示此基因相关突变对于TPP和SPP的发生可能具有相同的致病机制。本项研究在体外实验中进一步验证了上述4种Kir2.6突变通道的电生理功能缺陷。本项研究以pEFGP-C3为模板,在体外构建pEGFP-Kir2.6野生型质粒,并在此基础上诱导为pEGFP-Q126X、pEGFP-G169R、pEGFP-K360T及pEGFP-E388K突变型质粒。通过转染至COS-7细胞中以检测通道蛋白的表达分布,实验结果表明,与野生型相比,Q126X、G169R、K360T及E388K突变蛋白均分布在细胞质与细胞膜上。经转染至人胚胎肾(Human embryo kidney,HEK) 293细胞中,我们运用膜片钳技术检测Kir2.6突变通道介导的钾离子全细胞电流变化。Q126X与K360T突变通道的电流密度与非转染细胞相比无明显差异,表明这两种通道可能不具备内向整流功能。而与野生型通道相比,在电压为-60mV时,G169R和E388K通道的内向电流密度分别减小了65.6%及29.9%;而在电压为0 mV时,其外向电流密度分别减小了84.7%及62.7%。为了模拟患者体内突变通道的杂合突变形式,我们分别将pEGFP-Q126X、 pEGFP-G169R, pEGFP-K360T及pEGFP-E388K突变型质粒分别以质量1：1等比例与野生型质粒共转入HEK293细胞以检测电流变化。与野生型相比,在内向电压-60mV与外向电压0mV时,Q126X杂合型通道的电流密度分别减少了65.7%及91.4%；G169R杂合型通道的电流密度分别减少了48.2%及47.4%；K360T杂合型通道的电流密度分别减少了55.1%及54.3%；而E388K杂合型通道的电流密度分别减少了24.1%及41.1%,提示突变通道亚单位对野生型通道亚单位具有明显的负性效应。第三部分MicroRNA对周期性麻痹调控作用的分析MicroRNA(miRNA)是一类序列高度保守的内源性非编码小RNA分子。成熟miRNA通过与靶基因3’端非编码区结合,在转录或转录后水平调控基因的表达,广泛参与细胞的增殖、分化、免疫系统、凋亡、个体发育以及机体代谢等一系列生命过程。而特异性表达于骨骼肌成肌细胞及肌管中的miRNAs则定义为myomiRs (Myogenic microRNA)。多项研究报道,myomiRs已被证实参与肌肉生长发育的主要过程,如肌发生、肌纤维分化、肌肉生长及调节肌肉的内环境以应对外环境的刺激等。已有研究证实,在多种原发性及继发性肌肉病中,myomiRs的表达水平可有不同相关性变化。本项研究选取3例经临床诊断为SPP并行肌肉组织病理检查的患者为SPP组,同时选取3例因肌无力行肌肉组织病理检查,但实验室检查和肌肉病理诊断为大致正常的个体作为对照组。应用Afymetrix miRNA 4.0芯片技术筛选该两组肌肉组织标本差异性表达的miRNA分子,芯片结果显示21种miRNAs分子表达存在明显差异,其中16种miRNAs分子在SPP组表达下调,而5种miRNAs分子在SPP组表达上调。我们根据芯片结果及相关参考文献共挑选了4个可能与SPP发病相关的miRNAs,miRNA-181d、miRNA-34a、miRNA-122、miRNA-27b,进一步利用TaqMan探针实时定量PCR (Real-time PCR)的方法进行验证。结果显示,上述4种miRNA分子在患者组中较对照组表达明显下调,与芯片结果一致,推测miRNA分子可能参与SPP的致病过程。综上所述,本项研究对一大组116例TPP和SPP患者的KCNJ18基因进行序列分析,结果发现在一例SPP患者中存在一个新杂合点突变c.505G>C,导致氨基酸由甘氨酸变为精氨酸(p.G169R),其长时运动诱发试验结果符合周期性麻痹的表现；应用膜片钳技术对我们新发现的SPP相关突变(p.G169R),以及以往报道的3个中国人群TPP相关突变(p.Q126X、p.K360T和p.E388K)进行电生理功能验证,电生理检测结果表明,突变型Kir2.6通道的钾离子电导性明显减弱,且突变通道亚单位对野生型通道亚单位具有明显的负性效应；SPP组与对照组肌肉miRNA芯片检测结果提示,miRNA可能参与SPP相关致病过程。这些研究结果为了解TPP与SPP的致病原因提供了颇具意义的研究参考,此外,还为进一步明确两种疾病的发生过程提供了新的研究思路。