[目 的]建立稳定、快捷、高效分离乳猪肝细胞与kupffer细胞的实验流程,探讨kupffer细胞对共培养体系中肝细胞的功能、增殖及凋亡影响,为体外原代肝细胞与kupffer细胞共培养的应用及生物人工肝相关研究奠定基础。[方 法](1)参照Seglen两步灌注分离乳猪肝细胞的方法,并对其进行改进,联合Percoll液密度梯度离心法分离kupffer细胞,构建肝细胞与kupffer细胞Transwall间接共培养体系,将乳猪原代肝细胞随机分为两组:肝细胞单独培养组(简称单独组)和肝细胞与kupffer细胞按4:1比例共培养组(简称共培养组);(2)免疫荧光鉴定肝细胞及kupffer细胞,倒置相差显微镜下观察单独组及共培养组中细胞的形态和生长情况;(3)每24h收获各组细胞上清液,全自动化生化仪检测培养上清中天冬氨酸氨基转移酶和葡萄糖水平,ELISA法检测培养上清中白蛋白含量;(4)于培养第1d、3d、5d、7d收获各组肝细胞数,流式细胞仪技术检测各组肝细胞的凋亡率,酶联免疫检测仪检测各组肝细胞的增殖活力。[结 果](1)采用改良Seglen灌注法联合Percoll液密度梯度离心法,每头乳猪可获得肝细胞数目(1.24±1.65)×1010/整肝,根据台盼蓝拒染法计算细胞活度,肝细胞存活率为(92.4±2.55)%。KCs产率为(1.65±0.64)×109/整肝,纯度达(93±2.26)%。连续10d的形态学观察中,单独组肝细胞生长良好,但7d后细胞开始凋亡,至培养2周全部死亡,而共培养组肝细胞生长较单独组更好,培养10天肝细胞开始凋亡,至培养3周细胞全部死亡。(2)共培养组培养上清液中白蛋白含量在第1d较单独培养组低外,差异有统计学意义(P<0.05),其在第3d、7d均较单独组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)通过CCK-8法测定细胞的增殖活力,共培养组在第1d、3d、5d、7d的增殖活力高于相应时间点单独组的增殖活力,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)比较两组细胞第1d、3d、5d、7d的凋亡率,结果显示单独组肝细胞的凋亡率明显高于相应时间点共培养组肝细胞的凋亡率,差异有统计学意义(P<0.05)。[结 论]本实验成功建立了以改良Seglen灌注法分离乳猪肝细胞,联合Percoll液密度梯度离心法分离kupffer细胞的实验操作流程,该法稳定、高效、快捷。实验结果表明kupffer细胞与肝细胞在适宜的培养条件下可进行共培养,且肝细胞与kupffer细胞按4:1比例共培养可增强肝细胞分泌白蛋白,促进肝细胞增殖,并抑制其凋亡。