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目的：氧化损伤会导致皮肤伤口愈合延迟，核转录因子类红细胞-2因子(nuclear factor erythoid-2related factor2,Nrf2)是抗氧化应激防御的主要转录调节因子，因三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)具有促进伤口愈合的潜能，因此本实验旨在探讨T3是否通过激活Nrf2信号通路促进伤口愈合。
方法：实验分体外和体内实验。(一)体外实验：1.体外培养人永生化角质形成细胞(HaCaT)，用不同浓度(1nmol/L、0.5nmol/L、0.1nmol/L)的T3干预，MTT法检测细胞增殖活性。2.实验分组，每组5个样本：①正常组(未进行干预)；②H2O2组：用500μmol/L H2O2处理细胞2h以诱导氧化损伤；③ML385组：用20μmol/L ML385干预2h以抑制Nrf2表达；④ML385+H2O2组：用ML385干预2h后再用H2O2处理2h；⑤H2O2+T3(1nmol/L)组、⑥H2O2+T3(0.5nmol/L)组、⑦H2O2+T3(0.1nmol/L)组：用H2O2处理2h后再分别用1nmol/L、0.5nmol/L、0.1nmol/L的T3干预24h；⑧ML385+H2O2+T3(1nmol//L)组、⑨ML385+H2O2+T3(0.5nmol/L)组、⑩ML385+H2O2+T3(0.1nmol/L)组：用ML385干预2h后，再用H2O2处理2h，最后分别加入1nmol/L、0.5nmol/L和0.1nmol/L的T3干预24h。3.MTT法检测细胞毒性。4.细胞划痕实验观察细胞迁移能力。5.ELISA和比色法检测各组上清中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)等氧化应激相关指标以及白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子表达。6.Western blot检测各组细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达水平。(二)体内实验部分：1.在小鼠背部制作全层皮肤缺损模型。2.实验分组：①正常组：未制作模型，也未给予任何处理；②对照组：伤口每日涂抹凡士林乳膏；③125μg/mL T3组、④250μg/mL T3组、⑤500μg/mL T3组：伤口每日分别涂抹125、250和500μg/mL T3乳膏；⑥ML385组：小鼠每日皮下注射15mg/Kg ML385，2h后伤口再涂抹凡士林乳膏；⑦ML385+T3(500μg/mL)组：小鼠每日皮下注射ML385，2h后伤口再涂抹500μg/mL T3乳膏。3.每日观察小鼠背部伤口愈合情况。4.在伤后第3、7、14d分别收集各组小鼠血清和背部伤口皮肤进行组织学和分子生物学检测。5.检测各组小鼠血清中T3水平。6.HE染色观察组织病理学改变。7.免疫组织化学检测caspase-3和α-SMA的表达。8.ELISA和比色法检测各组上清中CAT、SOD、GSH、MDA、ROS、IL-6和TNF-α含量。9.Western blot检测各组小鼠背部伤口组织中Nrf2、HO-1蛋白表达水平。
结果：(一)体外实验：1.三个T3组细胞增殖活性显著高于正常组(P＜0.01)。经H2O2诱导后，三个T3组的细胞活性均较H2O2组高(P＜0.01)，而三个T3组之间没有差异(P＞0.05)。应用ML385干预后，三个ML385+H2O2+T3组与同浓度的H2O2+T3组相比，其细胞活性显著降低(P＜0.01)。2.H2O2组的划痕愈合率显著低于正常组(P＜0.01)，三个H2O2+T3组的划痕愈合率显著高于H2O2组(P＜0.01)，而三个组之间比较，没有差异(P＞0.05)。分别与同浓度的H2O2+T3组比较，三个ML385+H2O2+T3组的划痕愈合率显著降低(P＜0.01)。3.H2O2组ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平高于正常组(P＜0.05)，而GSH、CAT和SOD水平低于正常组(P＜0.01)。三个H2O2+T3组的ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平较H2O2组低(P＜0.01)，而CAT、GSH和SOD水平较H2O2组高(P＜0.01)，三个H2O2+T3组的这些指标水平没有明显差异(P＞0.05)。分别与同浓度的H2O2+T3组比较，三个ML385+H2O2+T3组的ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平增高(P＜0.01)，而CAT、GSH和SOD水平降低(P＜0.01)。4.H2O2组的Nrf2与HO-1的蛋白含量高于正常组(P＜0.01)，但低于三个H2O2+T3组(P＜0.01)，而三个ML385+H2O2+T3组分别与同浓度的H2O2+T3组比较，前者的Nrf2与HO-1的蛋白低于后者(P＜0.01)。(二)体内实验：1.对照组、500μg/mL T3组、ML385组和ML385+T3(500μg/mL)组四个组在各时间点的血清T3水平，与正常小鼠比较无明显差异(P＞0.05)。2.在伤后第3d和7d，三个T3组的创面愈合率显著高于对照组(P＜0.01)，同时ML385+T3(500μg/mL)组比三个T3组显著降低(P＜0.01)。3.三个T3组的组织病理学改变较对照组明显改善，并呈剂量依赖性改善，而ML385+T3(500μg/mL)组的病理学变化同对照组，不如T3组的改善。4.伤后7d，三个T3组的α-SMA和caspase-3阳性细胞数呈剂量依赖性较对照组明显增多(P＜0.01)，而伤后14d三个T3组呈剂量依赖性较对照组明显减少(P＜0.01)。ML385+T3(500μg/mL)组阳性细胞在伤后7d低于，在伤后14d高于三个T3组(P＜0.05)。5.伤后各时间点，500μg/mL T3组的ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平显著低于对照组(P＜0.05)，而GSH、CAT和SOD水平高于对照组(P＜0.05)。ML385+T3(500μg/mL)组的ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平高于500μg/mL T3组(P＜0.05)，而CAT、GSH和SOD水平低于500μg/mL T3组(P＜0.05)。6.在各时间点，500μg/mL T3组Nrf2和HO-1蛋白表达水平较对照组升高(P＜0.01)，同时ML385+T3(500μg/mL)组与500μg/mL T3组比较显著降低(P＜0.01)。
结论：1.T3通过激活Nrf2信号通路减轻H2O2诱导的HaCaT细胞毒性、氧化和炎性损伤。2.T3通过激活Nrf2信号通路促进全层皮肤缺损创面愈合。
方法：实验分体外和体内实验。(一)体外实验：1.体外培养人永生化角质形成细胞(HaCaT)，用不同浓度(1nmol/L、0.5nmol/L、0.1nmol/L)的T3干预，MTT法检测细胞增殖活性。2.实验分组，每组5个样本：①正常组(未进行干预)；②H2O2组：用500μmol/L H2O2处理细胞2h以诱导氧化损伤；③ML385组：用20μmol/L ML385干预2h以抑制Nrf2表达；④ML385+H2O2组：用ML385干预2h后再用H2O2处理2h；⑤H2O2+T3(1nmol/L)组、⑥H2O2+T3(0.5nmol/L)组、⑦H2O2+T3(0.1nmol/L)组：用H2O2处理2h后再分别用1nmol/L、0.5nmol/L、0.1nmol/L的T3干预24h；⑧ML385+H2O2+T3(1nmol//L)组、⑨ML385+H2O2+T3(0.5nmol/L)组、⑩ML385+H2O2+T3(0.1nmol/L)组：用ML385干预2h后，再用H2O2处理2h，最后分别加入1nmol/L、0.5nmol/L和0.1nmol/L的T3干预24h。3.MTT法检测细胞毒性。4.细胞划痕实验观察细胞迁移能力。5.ELISA和比色法检测各组上清中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)等氧化应激相关指标以及白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子表达。6.Western blot检测各组细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达水平。(二)体内实验部分：1.在小鼠背部制作全层皮肤缺损模型。2.实验分组：①正常组：未制作模型，也未给予任何处理；②对照组：伤口每日涂抹凡士林乳膏；③125μg/mL T3组、④250μg/mL T3组、⑤500μg/mL T3组：伤口每日分别涂抹125、250和500μg/mL T3乳膏；⑥ML385组：小鼠每日皮下注射15mg/Kg ML385，2h后伤口再涂抹凡士林乳膏；⑦ML385+T3(500μg/mL)组：小鼠每日皮下注射ML385，2h后伤口再涂抹500μg/mL T3乳膏。3.每日观察小鼠背部伤口愈合情况。4.在伤后第3、7、14d分别收集各组小鼠血清和背部伤口皮肤进行组织学和分子生物学检测。5.检测各组小鼠血清中T3水平。6.HE染色观察组织病理学改变。7.免疫组织化学检测caspase-3和α-SMA的表达。8.ELISA和比色法检测各组上清中CAT、SOD、GSH、MDA、ROS、IL-6和TNF-α含量。9.Western blot检测各组小鼠背部伤口组织中Nrf2、HO-1蛋白表达水平。
结果：(一)体外实验：1.三个T3组细胞增殖活性显著高于正常组(P＜0.01)。经H2O2诱导后，三个T3组的细胞活性均较H2O2组高(P＜0.01)，而三个T3组之间没有差异(P＞0.05)。应用ML385干预后，三个ML385+H2O2+T3组与同浓度的H2O2+T3组相比，其细胞活性显著降低(P＜0.01)。2.H2O2组的划痕愈合率显著低于正常组(P＜0.01)，三个H2O2+T3组的划痕愈合率显著高于H2O2组(P＜0.01)，而三个组之间比较，没有差异(P＞0.05)。分别与同浓度的H2O2+T3组比较，三个ML385+H2O2+T3组的划痕愈合率显著降低(P＜0.01)。3.H2O2组ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平高于正常组(P＜0.05)，而GSH、CAT和SOD水平低于正常组(P＜0.01)。三个H2O2+T3组的ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平较H2O2组低(P＜0.01)，而CAT、GSH和SOD水平较H2O2组高(P＜0.01)，三个H2O2+T3组的这些指标水平没有明显差异(P＞0.05)。分别与同浓度的H2O2+T3组比较，三个ML385+H2O2+T3组的ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平增高(P＜0.01)，而CAT、GSH和SOD水平降低(P＜0.01)。4.H2O2组的Nrf2与HO-1的蛋白含量高于正常组(P＜0.01)，但低于三个H2O2+T3组(P＜0.01)，而三个ML385+H2O2+T3组分别与同浓度的H2O2+T3组比较，前者的Nrf2与HO-1的蛋白低于后者(P＜0.01)。(二)体内实验：1.对照组、500μg/mL T3组、ML385组和ML385+T3(500μg/mL)组四个组在各时间点的血清T3水平，与正常小鼠比较无明显差异(P＞0.05)。2.在伤后第3d和7d，三个T3组的创面愈合率显著高于对照组(P＜0.01)，同时ML385+T3(500μg/mL)组比三个T3组显著降低(P＜0.01)。3.三个T3组的组织病理学改变较对照组明显改善，并呈剂量依赖性改善，而ML385+T3(500μg/mL)组的病理学变化同对照组，不如T3组的改善。4.伤后7d，三个T3组的α-SMA和caspase-3阳性细胞数呈剂量依赖性较对照组明显增多(P＜0.01)，而伤后14d三个T3组呈剂量依赖性较对照组明显减少(P＜0.01)。ML385+T3(500μg/mL)组阳性细胞在伤后7d低于，在伤后14d高于三个T3组(P＜0.05)。5.伤后各时间点，500μg/mL T3组的ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平显著低于对照组(P＜0.05)，而GSH、CAT和SOD水平高于对照组(P＜0.05)。ML385+T3(500μg/mL)组的ROS、MDA、IL-6和TNF-α水平高于500μg/mL T3组(P＜0.05)，而CAT、GSH和SOD水平低于500μg/mL T3组(P＜0.05)。6.在各时间点，500μg/mL T3组Nrf2和HO-1蛋白表达水平较对照组升高(P＜0.01)，同时ML385+T3(500μg/mL)组与500μg/mL T3组比较显著降低(P＜0.01)。
结论：1.T3通过激活Nrf2信号通路减轻H2O2诱导的HaCaT细胞毒性、氧化和炎性损伤。2.T3通过激活Nrf2信号通路促进全层皮肤缺损创面愈合。