一.红景天苷对失重性肌萎缩形成的影响及机制研究在航天飞行尤其是中长期航天飞行中，微重力将导致失重性肌萎缩的发生，主要以抗重力肌如比目鱼肌萎缩尤为严重，其特征性表现为肌肉重量丢失、肌纤维横截面积下降，并伴随慢肌纤维向快肌纤维类型转变。现有的物理对抗措施并不足以缓解失重性肌萎缩的发生，严重影响航天员在轨飞行任务的完成和返回地面后的健康恢复。面对我国空间站、载人登月等长期空间飞行的巨大挑战，亟需研发包括药物在内的新的有效防护对抗措施。我们前期的研究结果表明，尾悬吊模拟失重诱导的比目鱼肌萎缩中，对骨骼肌生长发育发挥重要调控作用的TGF-β1因子及下游关键信号介导因子Smad3被选择性激活；敲除Smad3可选择性抑制尾悬吊诱导的比目鱼肌肌肉重量丢失、肌纤维萎缩和慢肌纤维向快肌纤维类型的转变。以上结果提示Smad3可作为失重性肌萎缩对抗药物筛选的作用靶点。天然植物红景天及其有效活性成分红景天苷可以抑制肝肾脏组织中TGF-β1的表达，但未见红景天/红景天苷对骨骼肌中TGF-β1/Smad3通路表达影响的报道。本研究以野生型C57BL/6小鼠为实验对象，利用红景天苷或同等剂量PBS灌胃28天后，尾悬吊14天诱导失重性肌萎缩，分析红景天苷对失重性肌萎缩形成过程肌肉重量、肌纤维横截面积、快慢肌纤维含量以及TGF-β/Smad3信号通路表达的影响，并探讨Smad3在红景天苷影响失重性肌萎缩形成中作用的调控机制，主要研究结果如下：1、尾悬吊14天后，PBS处理组小鼠后肢背侧肌肉尤其是慢肌比目鱼肌肌肉重量明显减轻，肌纤维横截面积显著下降；红景天苷处理选择性抑制了尾悬吊诱导的慢肌比目鱼肌重量的丢失及肌纤维横截面积的下降，即对抗了尾悬吊诱导的比目鱼肌及其肌纤维的萎缩。2、在尾悬吊诱导的比目鱼肌萎缩形成过程中，骨骼肌特异表达的泛素连接酶Atrogin-1及MuRF1的表达明显增加；红景天苷处理后明显抑制了尾悬吊诱导的Atrogin-1及MuRF1的表达，提示红景天苷对抗失重性肌萎缩的作用可能与抑制了泛素蛋白酶体通路的激活有关。3、尾悬吊14天后，PBS处理组小鼠比目鱼肌慢肌纤维（MHC-I和MHC-IIa）含量明显减少，快肌纤维（MHC-IIb）含量明显增加；而红景天苷处理组小鼠比目鱼肌中MHC-IIa含量在尾悬吊后未发生明显改变，MHC-IIb的含量也比PBS处理组显著较少，说明红景天苷通过抑制尾悬吊诱导的MHC-IIa减少和MHC-IIb的增加显著对抗了慢肌纤维向快肌纤维类型的转变。4、Western blot的结果表明，红景天苷处理后抑制了尾悬吊诱导慢肌纤维相关蛋白Troponin I-SS的减少和快肌纤维相关蛋白Troponin I-FS的增加，进一步验证了红景天苷对尾悬吊诱导的慢肌纤维向快肌纤维类型转变的对抗作用。5、尾悬吊诱导的比目鱼肌萎缩后，TGF-β1/Smad3信号通路明显激活，红景天苷处理明显抑制了尾悬吊诱导的该信号通路的激活。6、在成功构建携带有Atrogin-1启动子序列报告载体的基础上，将Smad3表达质粒与pGL-3-Atrogin-1体内共转染，结果表明，骨骼肌内过表达Smad3可以诱导pGL-3-Atrogin-1荧光素酶的表达增加，提示Smad3可以激活Atrogin-1的转录水平。7、利用生物信息学的比对结果表明，小鼠Atrogin1基因转录起始位点上游-2115～-2107区域存在一个可能的Smad3的结合位点，但ChIP的结果表明，在尾吊后的比目鱼肌中，p-Smad3并未与Atrogin-1启动子区域的该位点结合，该结果提示，尾吊时p-Smad3的激活并未对Atrogin-1发挥直接转录调控作用，而可能通过与其它蛋白相互作用的方式间接调控了Atrogin-1的表达。8、目前已知的和Smad3存在相互作用的蛋白中，FOXO是唯一可以对Atrogin-1发挥直接转录调控作用的因子，ChIP-re-ChIP的实验结果表明，尾悬吊诱导比目鱼肌萎缩后，在Smad3抗体沉淀的DNA片段中可以检测到FOXO对Atrogin-1启动子位点的结合，该结果证明，在尾悬吊诱导的比目鱼肌萎缩形成过程中，激活的p-Smad3是通过与FOXO结合间接发挥了对Atrogin-1的转录调控作用。9、利用ChIP-re-ChIP的实验结果表明，红景天苷处理通过降低p-Smad3与FOXO在Atrogin-1启动子区域的结合丰度，抑制尾悬吊诱导的Atrogin-1的表达增加。10、为了验证p-Smad3是否介导了红景天苷对尾悬吊诱导的慢肌纤维向快肌纤维类型转变的对抗作用，我们应用Smad3基因敲除小鼠（Smad3+/-）及其同窝出生的野生型小鼠（Smad3+/+）尾悬吊后证实，Smad3基因敲除小鼠同样可以对抗尾悬吊诱导的MHC-IIa减少和MHC-IIb的增加，提示红景天苷可能通过抑制尾悬吊诱导的p-Smad3的激活发挥了对肌纤维类型转变的对抗作用。11、在成功构建携带有MHC-IIa或MHC-IIb启动子序列报告载体的基础上，我们证实，TGF-β1刺激可以明显抑制pGL-3-MHC-IIa的荧光素酶表达，增强pGL-3-MHC-IIb的荧光素酶表达；过表达Smad3后，TGF-β1对pGL-3-MHC-IIa荧光素酶表达的抑制作用及对pGL-3-MHC-IIb荧光素酶表达的增强的作用更加显著，提示p-Smad3的激活可以抑制MHC-IIa的转录而增强MHC-IIb的转录。12、利用生物信息学手段对大鼠和小鼠MHC-IIa或MHC-IIb转录起始位点上游3000bp序列的比对结果表明，在MHC-IIa和MHC-IIb基因启动子区域各自存在3个和2个保守的Smad结合位点（Smad binding element, SBE）。13、利用ChIP的研究结果证实，p-Smad3可以直接与靠近MHC-IIa或MHC-IIb转录起始位点的SBE结合，分别位于MHC-IIa基因转录起始位点上游-54～-44bp区域以及MHC-IIb基因转录起始位点上游-630～-622bp区域。14、利用点突变策略成功将pGL-3-MHC-IIa和pGL-3-MHC-IIb报告载体的上述SBE位点突变后，逆转了p-Smad3对MHC-IIa和MHC-IIb基因的转录调控作用，证实p-Smad3调控MHC-IIa和MHC-IIb基因转录必需依赖同上述SBE位点的直接结合。15、ChIP实验结果表明，红景天苷处理后通过抑制尾悬吊诱导的p-Smad3的表达，降低p-Smad3对慢肌基因MHC-IIa以及快肌基因MHC-IIb启动子区域的结合丰度，从而对抗了尾悬吊诱导的慢肌基因MHC-IIa的减少和快肌基因MHC-IIb的表达增加。通过以上研究证实，红景天苷可以选择性抑制模拟失重诱导的慢肌比目鱼肌萎缩及其慢肌纤维向快肌纤维类型的转变，并揭示了Smad3在红景天苷对抗失重性肌萎缩形成过程中的调控作用，该研究不仅为失重性肌萎缩的防护对抗提供了有效的分子靶点，也为以红景天苷为主要有效药理活性成分的天然植物红景天治疗失重性肌萎缩提供了科学依据。二.红景天苷对杜氏肌萎缩动物模型的治疗作用研究杜氏肌萎缩（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是由位于人类X染色体的dystrophin基因缺失导致的一种临床严重致死性疾病。由于DMD患者肌纤维中缺失dystrophin，出生后肌肉的运动收缩，容易引起肌纤维反复损伤再生、持续性炎性反应和纤维化等主要病理改变。TGF-β1因子的高表达被认为在DMD骨骼肌纤维化形成中起着关键的作用。在本研究中，我们以DMD疾病公认的mdx小鼠为研究对象，利用中药红景天活性成分红景天苷抑制骨骼肌TGF-β1因子表达，并利用尾悬吊减少mdx肌肉运动收缩，探讨中药组分红景天苷和物理制动方法对DMD疾病模型mdx的治疗作用。主要研究结果如下：1、HE染色的结果证明，mdx小鼠腓肠肌炎性反应剧烈；红景天苷能明显减轻mdx小鼠腓肠肌的炎性反应，使炎性因子的表达恢复至正常野生型小鼠水平。2、相比野生型小鼠，mdx小鼠腓肠肌成肌因子表达显著增加；红景天苷处理抑制了mdx小鼠腓肠肌内成肌因子的表达，提示红景天苷处理后减轻了腓肠肌内的损伤修复反应。3、相比野生型小鼠，mdx小鼠腓肠肌明显纤维化、成纤维因子表达增加，尤其以collagen Iα1增加最为明显；红景天苷明显的抑制了纤维化形成及collagen Iα1的表达。4、相比野生型小鼠，mdx小鼠腓肠肌中慢肌纤维基因表达减少，快肌纤维基因表达增加；红景天苷处理明显抑制快肌纤维表达，该结果提示，红景天苷可以抑制mdx小鼠骨骼肌中慢肌纤维向快肌纤维类型的转变。5、mdx小鼠腓肠肌中TGF-β1/Smad3信号通路明显激活；但红景天苷处理明显抑制了mdx小鼠腓肠肌内TGF-β1/Smad3信号通路的表达，提示红景天苷对mdx小鼠骨骼肌病理损伤的改善作用与抑制TGF-β1/Smad3信号通路的激活有关。6、mdx小鼠后肢背侧骨骼肌中以腓肠肌炎性反应最为明显，尾悬吊14天能明显减轻mdx小鼠腓肠肌中的炎性反应，减少中心核含量及坏死肌纤维的数目。7、尾悬吊14天能引起mdx小鼠骨骼肌肌纤维的萎缩，该结果提示，通过尾悬吊减轻mdx小鼠骨骼肌病理损伤的同时，应注重防护对抗肌萎缩的形成。以上结果表明，红景天苷可通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路、减轻纤维化而缓解DMD病人病理损伤，而尾悬吊制动也能减轻mdx小鼠的炎性及坏死反应；该研究可为制定DMD疾病的综合治疗方案提供参考。有关制动配合使用红景天苷是否有可能在增强对DMD病理损伤改善作用的同时、减轻因运动减少而导致的肌肉萎缩等负面效应，尚有待进一步研究。