目的：1、液氮深低温保存人羊膜上皮细胞（human Amniotic Epithelial Cells，hAECs）是否会对其干细胞活性产生影响，相关报道较少见。本研究从细胞形态学、细胞生长状况、细胞表面干细胞标志物及干细胞基因表达、细胞体外成骨细胞、成脂肪细胞多向诱导分化四个方面，来观察hAECs冻存前后的生物学活性和干细胞特性，以研究液氮深低温保存hAECs的可靠性。2、脓毒血症仍然是导致急性肺损伤（acute lung injury，ALI）最常见的原因，目前尚缺乏十分有效的治疗手段。本研究通过检测肺组织病理学切片、肺组织和血清中细胞因子的变化，来观察hAECs对内毒素性肺损伤的干预作用及其可能机制，以探讨人羊膜上皮细胞治疗急性肺损伤的可行性。方法：1、取健康产妇足月剖宫产后胎盘的羊膜组织，采用多次胰酶消化法获取hAECs，培养过程中经多次差别消化法逐步纯化hAECs。调整纯化的第2代（P2）细胞密度至5×106/mL，向细胞中缓慢加入新鲜配制的二甲基亚砜（DMSO）冻存液。将冻存管置于程序降温仪中，待温度降至-100℃后迅速移入液氮罐中保存。1个月后对细胞进行复苏培养，观察冻存前后hAECs的形态变化及增殖情况；并用流式细胞分析仪检测细胞表面标记物（CD29、CD73、CD166、CD44、CD90、HLA-ABC、CD34）；用RT-PCR法检测Oct-4及Nanog干细胞基因表达；同时在体外诱导hAECs向脂肪细胞、成骨细胞分化。数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量数据资料以均数±标准差（x s）表示，采用独立样本t检验法分析两组间的差异。2、向新生SD大鼠腹腔内注射大肠杆菌内毒素溶液20μL/g(5mg/kg)，制备脂多糖致急性肺损伤的动物模型。造模后2h经气管滴入CM-Dil荧光标记好的P2代hAECs。动物随机分组如下：（A）正常组（n=5）；（B）模型组（LPS）（n=5）：腹腔内注射LPS5mg/kg；（C）细胞组（n=5）：腹腔内注射LPS5mg/kg+气管内滴注hAECs（5×105个cells/40μL）；（D）对照组（n=5）：腹腔内注射LPS5mg/kg+气管内滴注40μLPBS液。分别在输注细胞24h、72h后，处死动物收取标本，每组每个时间点各5只大鼠。取肺组织标本固定，HE染色后观察肺损伤程度，测量肺损伤病理评分、肺泡间隔的厚度，测量肺干湿比（D/W）。用ELISA免疫吸附法检测肺组织丙二醛（MDA）浓度和超氧化物歧化酶（SOD）活性、同时检测血清中白介素10（IL-10）和白介素6（IL-6）的浓度。数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量数据资料以均数±标准差（x s）表示，用单因素方差分析法分析组间差异。结果：1、hAECs冻存前后的形态学无明显改变，均呈铺路石样膜状生长。与冻存前细胞相比，冻存后hAECs传代时所需的消化时间有所缩短（P<0.05），但细胞活率、传代时间、培养代数无明显改变。冻存前后细胞生长曲线均呈S型，冻存后细胞与冻存前细胞的生长周期相比，细胞经历滞留期、对数期和平台期的时间无明显差异。2、冻存后hAECs仍可以表达干细胞表面标记，CD73、CD29、CD166阳性率达90%以上，中度表达CD90、CD44，低表达I类白细胞抗原(HLA-ABC)，不表达造血干细胞标志CD34。RT-PCR法检测Oct-4及Nanog基因表达均呈阳性。体外诱导后，冻存前后的hAECs均可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。3、腹腔内注射LPS后，肺组织可见不同程度充血、血管内皮损伤出血，部分肺泡萎陷不张，部分肺泡间隔增厚、破坏。模型组与正常组相比，肺损伤病理评分、肺泡间隔的厚度均有显著增加（P<0.01）、肺干湿比减低（P=0.04）。检测肺组织和血清中的生化指标发现， MDA浓度有所升高伴SOD活性减低，模型组与正常组比较，两者的变化都尚未达到统计学意义（P>0.05）。模型组血清中促炎症因子IL-6水平逐渐升高，抗炎因子IL-10的水平逐渐减低，与正常组相比，IL-6水平24h为1.25±0.01（P=0.762），72h为1.61±0.29（P=0.006）；IL-10的水平24h为13.68±1.14（P=0.219），72h为12.49±0.40（P=0.005），两种因子在血清中的浓度变化72h时差别具有统计学意义。4、输入hAECs细胞后，细胞组与对照组相比，24h和72h时肺损伤评分、肺泡间隔厚度均有显著降低（P<0.01），差别具有统计学意义。细胞组中肺干湿比（D/W值）与对照组相比有所升高，24h时P=0.046，差异具有统计学意义，72h时P=0.366差异无明显统计学意义。细胞组氧化因子MDA的浓度在肺组织中逐渐减低，抗氧化因子SOD活性逐渐升高，与对照组对比，差别具有统计学意义。细胞组中促炎症因子IL-6水平降低，抗炎因子IL-10水平升高，与对照组相比72h时P<0.05，差异具有统计学意义。结论：1、冻存后的hAECs除细胞贴壁性有所下降外，细胞形态、细胞生长周期、细胞表面干细胞标记及其多向分化的潜能均没有改变，说明液氮深低温保存不影响hAECs的生物学特性，可以成为保存hAECs的一个可靠方法。2、气管内输入hAECs后，肺组织损伤评分减少、肺泡间隔的厚度缩小，肺水肿减轻，说明可以hAECs可以减少炎性细胞的浸润，减轻肺泡渗出，对内毒素导致的ALI具有修复作用。3、hAECs能够通过减轻局部氧化应激反应，调节促炎因子和抗炎因子的平衡，减轻炎症反应，保护受损组织，促进组织恢复