前言蛋白激酶C（Protein KinaseC，PKC）是最早被确认的蛋白激酶之一，是结构相近、钙和磷脂依赖、甘油二酯（DAG）激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，通过丝氨酸/苏氨酸磷酸化来调节各种细胞包括肿瘤细胞的不同功能，在介导细胞的生长、分化和死亡等信号传导中有其重要作用。近年来发现PKC参与肿瘤的发生、发展，是肿瘤细胞粘附、运动、侵袭和转移的关键因素。PKC同工酶的cDNA分析表明，该多肽链其氨基端一半序列为调节域（Regulatory Domain），其羧基端一半序列为催化域（Catalytic Domain），两者之间通过一个可被蛋白酶水解的铰链区（Hinge Domain）连接，该区在酶的激活过程中发生降解，从而使PKC活性部位暴露。在调节域还含有假底物位点，其与真底物位点的差别在于磷酸化位点的丙氨酸取代了丝氨酸/苏氨酸残基，因而不被磷酸化，从而封闭酶的活化中心。由于假性底物的存在，静息状态下PKC均以无活性的形式存在于胞浆中，在外界刺激作用下，PKC移位（translocation）到胞膜而被激活。短暂的PKCs激活，在信号传导通路中所致的短期事件（如离子内流、分泌等）方面似乎起着重要作用；持续的PKC激活，可能在细胞增殖、分化及肿瘤发生等方面起着重要的作用。PKC是促癌剂PMA（phorbol，12-myristate-13-acetate，即佛波醇-12-豆蔻酰-13-乙酸）细胞内受体，PKC的过度表达导致细胞生长紊乱，并且触发肿瘤的形成。Efferth等通过免疫细胞化学方法研究PKC在18种人肾细胞癌系中的表达。结果发现，PKC的高表达与癌细胞对阿霉素的耐药和P糖蛋白的高表达密切相关。从而证实PKC通过磷酸化和对P糖蛋白的调节参与肾细胞癌的内源性耐药。PKC广泛存在于动物、微生物等有机体内，并分布在几乎所有的组织和器官中。迄今为止，根据同工酶的结构、酶的特性、激活剂的不同等将其分为四大类至少十三种PKC亚型：经典PKC（classical PKC，cPKC）：α、β_Ⅰ、β_Ⅱ、γ，由钙、磷脂、二酰基甘油（DAG）或佛波酯激活；新型PKC（novel PKC，nPKC）：ι/η、δ、ε、θ，不依赖钙而由磷脂、二酰基甘油（DAG）或佛波酯激活；非典型PKC（atypical PKC，aPKC）：τ/λ、ξ仅由磷脂类物质激活；近来又发现一种PKC-μ，不需钙、DAG激活，而由磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸激活，但在结构上与前三种部分类似，故称为第四种PKC。各种PKC同工酶的分布及其作用各有特殊性。我们应用体外研究的方法，在PKC亚型水平探讨肾细胞癌的多药耐药机制及逆转，为肾细胞癌的治疗提供实验依据。实验分三部分：1、采用Western Blotting技术检测30例肾癌组织及其周围正常组织胞浆、胞膜中PKCα的表达。2、采用基因工程技术构建整合有PKCα基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因的真核表达载体，利用脂质体介导法在体外将PKCα基因导入人肾癌786-0细胞，利用荧光倒置显微镜、Western Blot、RT-PCR检测PKCα基因的表达情况；观察PKCα激动剂Calphostin C、抑制剂PMA作用前后PKCα/786-0细胞中PKCα转位状态；检测PKCαcDNA对肾癌786-0细胞的转染前及转染后细胞中MDR相关基因MDR1、MRP1、LRP的表达变化；采用MTT方法测定PKCα基因转染对肾癌细胞耐药性的影响。3、RT-PCR观察PKCα激动剂Calphostin C、抑制剂PMA作用前后MDR1基因表达变化；以MTT法测定Calphostin C、PMA对肾癌细胞细胞生长抑制率；测定阿霉素（ADM）与PKC激动剂以及与PKC抑制剂协同作用后,786-0细胞和肾癌转染细胞系PKCα/786-0耐药性的变化。方法一、实验材料主要试剂：786-0人肾癌细胞系，购自中国上海细胞所细胞库；PKCαcDNA全长开放阅读框架（Open Reading Frame；ORF）、羧基端融合绿色荧光蛋白（C-terminal fusion to Green Fluorescent ProteinP）哺乳动物细胞表达载体pcDNA-DEST47、脂质体Lipofectamine2000、Trizol试剂购自Invitrogen公司；QIAprep Miniprep Kit购自QIAGEN公司；G418：美国Gibercol BRL公司产品；用20mmol/L的HEPES稀释成100μg/ml；0.2μm过滤器过滤除菌；保存于-20℃备用；Calphostin C、ADM购自Sigama公司；PMA购自上海康成公司；PKCα抗体购自博士德公司；M-PER Mammalian Protein Extraction Regent试剂购自PIERCE公司；第二抗体羊抗兔IgG、组蛋白Ⅲ-S、鱼精蛋白均为Sigma公司产品。主要仪器：温育箱、切片机、光学显微镜、高压锅、冰箱、显微照相装置、紫外/可见光光度计、低温超速离心机、组织匀浆机、超声粉碎机、转印仪、摇床、电泳仪、自动电泳凝胶成像分析仪、-70℃深冻冰箱、流式细胞仪、烤片机、荧光倒置显微镜等。二、实验方法1、肾癌组织及其周围正常组织胞浆、胞膜中PKCα的表达。选取2001年-2003年我院经手术切除的肾癌组织及其周围正常组织的石蜡标本各30例，均经病理证实。男21例，女9例。年龄37岁～77岁，平均57.0岁。左侧肾癌16例，右侧肾癌14例。25例病例行经腹肾癌根治手术，4例行经腰肾癌根治手术，1例行经腰肾切除术。所有病例均为初发，术前未行放、化疗和免疫治疗。病理分期参照Robson分期法，组织学分级参照Cleveland Clinic分级标准。采用Western Blot技术检测PKCα在肾癌肿瘤组织和临近正常组织胞浆、胞膜中的表达。2、细胞培养细胞置于37℃，饱和湿度，含5％CO2的孵箱中培养，培养液为含有10％新生小牛血清的RPMI1640，每2-3天传代一次，取对数生长期的细胞进行实验。3、构建pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表达载体创建羧基端融合绿色荧光蛋白的pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表达载体。4、基因转染786-0细胞以pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表达载体作为目的基因，以荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的即时表达，观察转染效率。5、PKCα/786-0细胞株的筛选建立与鉴定786-0细胞系G418筛选试验产生阳性克隆，收集后传代扩增，命名为PKCα/786-0细胞株。（1）荧光倒置显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白的稳定表达；（2）收集细胞进行Westem Blot、RT-PCR检测PKCα表达。6、PKCα激动剂、抑制剂PMA作用前后PKCα/786-0细胞中PKCα转位变化。7、RT-PCR检测转染细胞转染前后细胞内MDR1、MRP1、LRP表达。MDR1：上游引物5’-ACACCCGACTTACAGATGATGTCTC-3’，下游引物5’-CGAGATGGGTAACTGAAGTGAACAT-3’，扩增产物为623bp；MRP1：上游引物5’-AGTGACCTCTGGTCCTTAAACAAGG-3’，下游引物5’-GAGGTAGAGAGCAAGGATGACTTGC-3’，扩增产物为657bp；LRP：上游引物5’-GAGCAGTTCACAGTGTTGTCC-3’，下游引物5’-GCGTGACGACAGAAACCGAAA-3’；扩增产物为342bp；β-actin作为内参照。结果用FluorChem凝胶分析系统分析。8、MTT方法测定PKCα基因转染对肾癌细胞耐药性的影响。9、RT-PCR观察PKCα激动剂、抑制剂作用前后MDR1基因表达变化。10、MTT法测定Calphostin C、PMA对肾癌细胞细胞生长抑制率。11、测定阿霉素（ADM）与PKC激动剂以及与PKC抑制剂协同作用后，786-0细胞和肾癌转染细胞系PKCα/786-0耐药性的变化。结果1、PKCα在肾癌和临近正常组织胞浆、胞膜中的表达：（光密度值）正常组织胞膜：2547.27±547.34；肿瘤组织胞膜：5402.59±694.12*；正常组织胞浆：11426.23±6756.92；肿瘤组织胞浆：6756.92±1474.92*；正常组织膜/浆比：0.22±0.12；肿瘤组织膜/浆比：0.80±0.15（*P<0.01）可见，PKCα在肾癌与临近正常组织胞浆、胞膜中的表达明显不同。1、PKCα在肾癌肿瘤组织胞浆、胞膜中的表达与肿瘤病理分期、细胞分级相关。2、PKCαcDNA扩增产物测序后，NCBI BLAST验证为所需基因片断。3、pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表达载体对786-0细胞的转染：786-0细胞利用脂质体转染pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表达载体后，未见细胞内出现异常颗粒或空泡化。24小时后荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的即时表达，加入G418后第2天即出现大量细胞死亡，第7天可见个别区域细胞呈岛状生长，细胞岛处细胞呈增生象，第14天散在的细胞几乎全部死亡（对照组细胞也全部死亡），细胞岛处细胞密度进一步增高、区域扩大。第20天时荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达说明pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表达载体己转染到786-0细胞内，该细胞命名为PKCα/786-0。荧光倒置显微镜证实转基因细胞中有绿色荧光蛋白的阳性高表达。结果经Western Blot验证，DNA不同转染条件均出现了明显印迹，说明存在PKCα蛋白的高表达，转染成功。RT-PCR也证实转染后肾癌细胞中存在PKCα基因的高表达。4、PKCα/786-0细胞株中，PKCα主要位于胞浆，呈弥漫分布，核周表达极少处于未激活状态。荧光显微镜检测激活/抑制状态下PKCα-GFP的分布结果发现：抑制剂PMA处理后，PKCα从胞浆内，迅速分布到核内和核膜处，胞浆内几乎无表达，细胞进入激活状态。而加入Calphostin C处理后，PKCα的分布与未786-0细胞相似，PKCα有重新归位于胞浆，核周荧光表达少，从而进入抑制状态。激活/抑制PKCα状态下，胞浆和胞膜均发生PKCα-GFP的转位。5、KCα与MDR相关基因的RT-PCR结果，经FluorChem凝胶分析系统分析。MDR1在PKCα/786-0表达中增加，而MRP1和LRP在转染前后差异不大，表明肾癌转染细胞系PKCα/786-0的MDR1表达水平高于肾癌786-0细胞。6、786-0细胞对ADM的IC₅₀为7.8015e^-7(5.7046e^-7～1.0669e^-6)；PKCα/786-0对ADM的IC₅₀为1.6588e^-6(1.1621e^-6～2.3677e^-6)。PKC激动剂PMA联合ADM处理PKCα/786-0的IC₅₀为2.6794e^-6(2.0521e^-6～3.4983e^-6)；PKC抑制剂CalphostinC联合ADM处理PKCα/786-0的IC₅₀为9.2506e^-8(5.9337e^-8～1.4422e^-7)。7、Calphostin C、PMA作用后MDR1基因表达分别出现升高和降低。8、Calphostin C协同ADM对肾癌细胞具有较强的抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖关系。对肾癌PKCα/786-0细胞的抑制率最低为13.9％，最高为59.6％。PMA处理后的细胞存活率比未加干扰因素的PKCα/786-0多32.7％；转染后PKCα/786-0对阿霉素（ADM）的IC50{1.6588e^-6(1.1621e^-6 to 2.3677e^-6)}是786-0{7.8015e^-7(5.7046e^-7 to 1.0669e^-6)}的2.13倍（P<0.01）；而给予PKC特异性激活剂PMA的PKCα/786-0的IC50{2.6794e^-6(2.0521e^-6 to 3.4983e^-6)}增加了1.62倍（P<0.05）；当给予PKCα抑制剂Calphostin C时，PKCα/786-0对药物阿霉素（ADM）的IC50{9.2506e^-8(5.9337e^-8 to 1.4422^-7)}则下降17.93倍（P<0.01），与786-0相比下降了8.43倍（P<0.01）。结论1、KC-α在肾癌肿瘤组织中存在膜转位；PKCα在肾癌发生发展过程中可能起了重要的调控作用。2、PKCα在肾癌组织胞膜中高表达，在肾癌组织胞浆中低表达，并且与肾癌的病理分期和细胞分级密切相关。3、PKCα基因可被成功转染入人肾癌细胞并稳定表达。4、PKC在胞膜与胞液中均有分布，与其活性状态有关。持续的PKC激活，可能在细胞增殖、分化及肿瘤发生等方面起着重要的作用。PKCα特异抑制剂Calphostin C通过抑制PKCα的膜转位使人肾癌细胞处于失活状态，不能对相应底物产生相关作用。5、蛋白激酶C-cDNA可以上调肾癌细胞786-0 MDR1表达量，可能导致肾癌多药耐药性的提高。6、PKCα的选择性激动剂和选择性抑制剂则分别可以增加和逆转肾癌细胞对ADM的耐药性。7、PKCα是判断肾癌分化、预后的一种理想指标。