人体内的抗体、记忆细胞、抗原递呈细胞是沿淋巴管在器官和周围淋巴组织之间循环的,中枢神经系统是机体少数自身具有免疫功能的器官之一,中枢神经系统内不存在淋巴管道,脑组织间液沿动脉和毛细血管壁间隙流动,并最终通过颈部淋巴系统引流出脑[1]。脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)是脑组织所处的内环境,因此保证脑脊液正常PH值和渗透压对于维持颅内内环境的稳态、保证脑部正常的结构和功能具有重要意义。临床上由于各种疾病或疾病治疗引起脑内淋巴液引流受阻,导致脑内淋巴液滞留,进一步引发脑组织结构和功能障碍,即淋巴滞留性脑病(lymphostatic encephalopathy, LE)[2]。引起淋巴滞留性脑病的原因有多种,除颅内病变和血脑屏障损伤之外,主要由治疗脑部或者颈部肿瘤过程中的放疗和颈部淋巴结的清扫对颈部淋巴引流系统造成的破坏所致。随着肿瘤患者的增加,淋巴滞留性脑病的发生率也随之上升。临床上LE症状主要为：颅内压升高导致的恶心、呕吐、头晕等症状和神情恍惚、注意力不集中等精神情志症状。根据以往有关淋巴滞留性脑病的研究报道,LE可引起延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulls, RVLM)脑组织神经元损伤,并导致一系列自主神经系统的紊乱,影响体温、血压以及心率的自主调节[3],但对于LE所致脑部高级中枢功能区神经元病变以及其分子致病机制和治疗药物的研究却鲜有报道。大脑前额叶皮质区(the prefrontal cortex, PFC)与学习记忆密切相关,大脑皮层的较高级功能区大部分分布于PFC区,但目前有关LE对脑组织PFC区神经元所致损伤的研究较少[4]。一氧化氮(nitric oxide, NO)与中枢神经系统多种疾病有关,它既有保护脑组织神经元正常代谢的作用,也具有细胞毒性作用[5、6]。一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)是NO合成的关键酶,其中诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)可由神经元细胞合成,分布于神经细胞的细胞质内,通过催化合成NO发挥作用,是导致神经元损伤的重要原因之一[7、8]。羟基红花黄素A(hydroxysafflor yellow A, HS YA),被广泛应用于心脑血管疾病的治疗[9],但其应用于淋巴滞留性脑病治疗的记录鲜见报道。本实验拟通过观察LE组大鼠PFC区脑组织神经元形态结构的改变、脑淋巴液滞留导致的诱导型一氧化氮合成酶表达量的变化以及羟基红花黄素A对脑组织PFC区神经元形态及iNOS蛋白表达的影响,探讨脑内淋巴液滞留导致的大鼠PFC区脑组织神经元的形态损伤程度及其分子致病机制,以及LE的治疗药物,为LE的临床诊断及治疗提供参考。研究目的1.观察各组大鼠前额叶皮质区神经元形态结构的改变。2.观察各组大鼠前额叶皮质区诱导型一氧化氮合成酶的表达量。3.探究羟基红花黄素A对淋巴滞留性脑病大鼠PFC区脑组织神经元的作用效果。研究方法1.实验动物及分组健康状况一致的雄性Wistar大鼠65只,SPF级,体重170～230g,随机分为假手术组(SHAM组)、加羟基红花黄素A组(HSYA组)和脑淋巴液滞留组(LE组),各组又根据术后时间分为术后1天、7天、14天三个组,共计9组,每组7只,实验过程中意外死亡的大鼠由剩余的大鼠补充。2.动物模型的建立参照淋巴滞留性脑病模型建立的步骤[9、10],对LE组和HSYA组分离并摘除颈部淋巴结,SHAM组只进行分离淋巴管和淋巴结的操作,但不结扎淋巴管且不摘除淋巴结,其他操作与LE组和HSYA组相同。3.切片制作及染色所有1天、7天、14天组各取2只大鼠直接冰上取PFC区脑组织进行固定、切片。每组剩余5只大鼠多聚甲醛心脏灌注后开颅取前额叶皮质区脑组织进行蜡块制作,并行后续的切片、展片、烤片等工作。石蜡切片脱蜡处理后进行苏木精—伊红染色和免疫组织化学染色。4.透射电镜和光镜的观察透射电子显微镜下观察PFC区神经元细胞和髓鞘的变化；PFC区脑组织切片经苏木精—伊红染色后,光学显微镜下观察该区神经元形态学的损伤；脑组织切片经免疫组织化学染色后光学显微镜下观察各组大鼠PFC区脑组织神经元iNOS的表达量,以及HSYA对iNOS表达量的影响。5.统计学分析使用SAS V9.3Chinese对经IPP图像分析软件所获得的数据进行汇总和编程分析,P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1.光学显微镜下大鼠PFC区脑组织神经元的形态光学显微镜下SHAM组中的1天、7天、14天各组之间差别不大,均表现为神经元结构清晰完整,胞浆着色均匀,呈粉红色；胞核染色后呈现蓝色且与胞浆分界清晰、形态规则,细胞核内的染色质分布均匀。HSYA组PFC区脑组织切片经HE染色后,光镜下1天和14天组的神经元形态结构差别不大,镜下表现与SHAM组类似,HSYA组的7天组PFC区脑组织神经元可以观察到：神经细胞边界模糊并有轻微的核染色加深。LE组1天、7天、14天组中均见神经细胞排列紊乱、形态不规则、细胞膜边界不清晰、核染色加深、核膜破裂,尤其以LE7天组最明显,LE1天和14天组亦可观察到上述神经细胞损伤的迹象,但神经元损伤数目和程度较7天组降低。2.透射电镜下PFC区脑组织神经元形态观察透射电子显微镜下SHAM组PFC区脑组织神经元结构完整,形态较规则,无凋亡和坏死现象,且1天、7天、14天各组之间无明显差别,胞浆内的电子密度分布正常,细胞核规则,核仁清晰。HSYA组和SHAM1天、14天组PFC区脑组织神经元电镜图片区别不大,均表现为神经元结构完整,形态较规则,核膜结构清晰完整；HSYA7天组部分神经元出现一定程度的损伤,但较LE组损伤程度轻。LE组PFC区脑组织1天、7天、14天组神经元均有不同程度损伤,其中7天组损伤严重,表现为部分神经元出现细胞核固缩、核仁边界模糊、核染色体出现团块状甚至解离消失、胞体变形且近乎解离。3.透射电镜下PFC区脑组织髓鞘观察髓鞘是包裹在神经元周围的脂类和蛋白质物质,对神经元具有保护作用[11]。SHAM组PFC区脑组织神经元髓鞘结构形态正常,各层之间排列紧密,无髓鞘分层解离迹象,且1天、7天、14天各组之间无显著差异。HSYA组和SHAM组的1天、14天组PFC区脑组织神经元髓鞘结构基本相同,均无明显解离；HSYA组7天组部分髓鞘结构松散卷曲且出现分层,但无髓鞘断裂现象。LE组1天、7天、14天各组神经元和髓鞘均有不同程度损伤,其中7天组损伤严重,髓鞘卷曲破裂且严重分层,部分区域髓鞘完全断裂。4.各组诱导型一氧化氮合成酶表达量的改变SHAM1天、7天、14天各组PFC区脑组织神经元iNOS表达量差异不大,棕黄色颗粒数目少、颜色浅。HSYA1天组神经元胞质内沉淀量较SHAM1天组多,但与LE1天组相比,后者神经元内棕褐色沉着量明显高于HSYA组,二者的平均光密度值差异有统计学意义(P<0.05)。LE1天组、7天组胞质内棕黄色颗粒沉积显著增多,其中LE1天组平均光密度值明显高于其他组(P<0.05)；术后14天得以改善,平均光密度值与其他组差异仍然较大。实验结论1.LE可导致大鼠大脑PFC区神经元形态损伤,髓鞘解离。2.LE可诱发PFC区神经细胞合成大量诱导型一氧化氮合成酶,这可能直接导致神经细胞形态的损伤。3.羟基红花黄素A可以降低PFC区iNOS的表达,并减轻神经元损伤程度。