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第一部分细菌内同源重组构建含hNGFβ基因的腺病毒质粒目的细菌内同源重组制备含hNGFβ基因的重组腺病毒质粒,在293细胞内包装后纯化重组腺病毒。方法将hNGFβ外源性核酸片段插入到经XmaⅠ与XbaⅠ酶切的pBluescriptⅡsk(+),构建成转移质粒pBluescriptⅡsk(+)—hNGFβ,将其经Kpn I和Not I双酶切后,与经同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV定向重组,构建成穿梭质粒pShuttle-CMV-hNGFβ,将该穿梭质粒经PmeⅠ酶切后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态菌BJ5183,重组为pAdEasy-1-hNGFβ,酶切鉴定正确后,用Lipofect介导转染AD293细胞,包装为重组腺病毒Ad-hNGFβ后用PCR鉴定。透析纯化后的腺病毒采用紫外分光光度计进行滴度测定。结果线性化的pShuttle-CMV-hNGFβ转化含pAdEasy-1的感受态菌BJ5183,24h后获得了30%阳性重组质粒,经酶切得到一条大于20kb的大片段和一条4.5kb的特征性条带,PCR扩增出731bp片段。纯化后测得滴度为2.24×1012OPU/L。结论应用细菌内同源重组能快速构建含hNGFβ基因的重组腺病毒载体pAdEasy-1-hNGFβ,酶切鉴定,包装为高滴度的重组腺病毒Ad—hNGFβ,为hNGFβ基因的应用研究奠定了基础。第二部分Ad-hNGFβ在原代培养的脊髓星形胶质细胞的表达及其生物活性的研究目的:以体外培养新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞为靶细胞,证明其能表达有生物活性的目的基因产物,观察前期所重组的Ad-hNGFβ对靶细胞的存活及毒性作用,为下一步的在体研究打下基础。方法:从新生SD大鼠的脊髓组织中分离星形胶质细胞(Astrocyte,Ast),应用DBEM/F-121∶1培养基进行原代培养及扩增,用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光法进行鉴定。用重组腺病毒Ad-hNGFβ(MOI为100)转染Ast后,用免疫组化法,初步测定培养3天时Ad-hNGβ的表达情况;用ELISA方法测定培养3d、6d及9d时,培养上清中NGFβ的含量;用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞OD570值,分析细胞对Ad-hNGFβ的敏感性;用流式细胞仪对转染细胞进行倍体分析,观察对细胞的生长抑制作用。结果:从新生SD大鼠的脊髓组织中成功分离培养出星形胶质细胞,GFAP免疫荧光阳性。脊髓星形胶质细胞可被Ad-hNGFβ感染并表达hNGFβ;试验组hNGFβ表达量与对照组同期相比,均有显著差异,P<0.01;并且随着细胞培养时间的延长,hNGFβ表达量下降,第9天与前两次比均有显著差异,P<0.01。经噻唑蓝测定,试验组BTT的吸光值OD570与对照组比有显著差异,P<0.01。流氏细胞仪测得细胞凋亡与MTT结果同步。结论:Ad-hNGFβ能在原代培养的脊髓背角星形胶质细胞中表达,表达高峰时间约在第三天。MOI为100时无明显细胞毒作用,且能够增加细胞活性。第三部分:鞘内注射Ad-hNGFβ对神经痛作用的研究目的:研究鞘内注射Ad-hNGFβ对CCI大鼠疼痛的影响及机制。方法:建立CCI动物模型后,随机分为Ⅰ组:CCI术后立即L5~L6处鞘内注射Ad-hNGFβ;Ⅱ组:CCI术后立即L5~L6处鞘内注射人工脑脊液ACSF;Ⅲ组:假手术组,除不行坐骨神经结扎外,其它同Ⅱ组。测定术前、术后每4日各组大鼠足底热痛阈、机械痛阈值(最终结果以手术侧:非手术侧的比值表示)及行为学评分。分别于术后4天、7天、14天、28各天取8只动物麻醉后,4只灌注固定,取L4~L6段脊髓,免疫组化法测定脊髓背角痛物质SP、CGRP的变化;另4只不灌注固定,麻醉后直接断头处死,冰上快速取L4~L6脊髓匀浆后ELISA法测定hNGFβ的含量。结果:所有CCI动物术后0~28天均出现痛觉过敏,出现明显的疼痛行为学改变和热痛阈、机械痛阈的降低。CCI术后立即鞘内注射Ad-hNGF β动物自术后第4天开始热痛敏明显减轻,与同一时点CCI+ACSF组比,P<0.05;整体疼痛行为学有所改善,但无显著差异;机械痛敏无明显改变。同时,注射Ad-hNGF β动物术后第4~28天脊髓hNGF β明显升高,与术前比,P<0.01;术侧脊髓背角SP较ACSF组明显减少,P<0.01或P<0.05;CGRP无明显改变。结论:CCI术后立即L5-L6处鞘内注射Ad-hNGF β可明显减轻热痛敏,该改变与hNGF β在脊髓表达增加和SP表达减少有关。