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传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。天然免疫(innate immunity)是机体防御病原体感染的第一道防线,在启动机体的获得性免疫应答中起着十分重要的作用。microRNA (miRNA)是一种21-25nt的小分子RNA,是基因表达的调控子,本研究以IBDV为模式病毒,探讨了miRNA在机体中调控干扰素、p53和模式识别受体抗IBDV天然免疫的分子机制。1传染性法氏囊病病毒对鸡法氏囊组织中干扰素和p53转录的影响为了分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染鸡体内干扰素和p53转录水平差异变化,用IBDV弱毒(B87)和强毒(QL/12)分别感染4周龄SPF鸡,每隔12h时(12～84h)取3只鸡的法氏囊组织混合匀浆,用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测其感染前后干扰素(IFN)和p53的mRNA水平,同时分析法氏囊组织的病理变化和病毒载量。结果显示:QL/12组,IFN-αα和IFN-β mRNA水平随着时间的增加逐渐升高,48h达到峰值,随后降低;IFN-γ mRNA水平随着时间的增加逐渐升高,60h达到峰值,随后逐渐降低;p53 mRNA含量迅速升高,60h达到峰值(比正常SPF鸡高约90倍),随后降低。B87组,IFN-αmRNA水平先降低后升高(48h达到最低值),而IFN-β mRNA水平变化不规则,72h含量最高;IFN-y mRNA水平先逐渐升高后降低(72h达到峰值);p53 mRNA含量变化较小,36h含量最高(比正常SPF鸡高约5倍);QL/12组诱导法氏囊组织产生的 IFN mRNA (IFN-α、IFN-β 和 IFN-γ mRNA)以及 p53 mRNA 水平均显著高于B87-IBDV组。病理组织学检查可见:与正常对照组相比,QL/12组法氏囊淋巴滤泡呈不同程度的损伤,B87组法氏囊组织未见明显的组织病变。qRT-PCR检测IBDV病毒载量,QL/12组法氏囊组织中病毒含量48h达到峰值(8.4×106copies/mg),而B87组法氏囊组织中病毒含量72h达到峰值(6.6×104copies/mg)。本研究为分析鸡体内IFN和p53介导的抗IBDV天然免疫中的作用奠定了基础。2鸡p53抑制传染性法氏囊病病毒复制及gga-miR-2127对其调控机制传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。肿瘤抑制蛋白p53能够抑制多种病毒的复制,但对IBDV复制的影响仍然不清楚。本研究以IBDV为模式病毒,采用体外感染模式,在IBDV感染的DF-1细胞中,p53的表达水平和活性均显著升高。p53过表达可以抑制IBDV的复制,并激活鸡体抗病毒天然免疫基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的表达水平上调;p53抑制表达则得到相反的结果;表明p53可以激活鸡体的抗病毒天然免疫反应发挥抗IBDV感染作用。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现gga-miR-2127可以作用于p53的3’UTR; qRT-PCR和免疫印迹分析表明gga-miR-2127可以使p53的蛋白水平表达降低,但mRNA水平没有变化;gga-miR-2127过表达可以使鸡体的抗病毒天然免疫基因表达降低,IBDV复制水平升高。本研究表明:gga-miR-2127可以作用于p53的3’UTR调控p53的表达来发挥抗IBDV感染的作用。3 gga-miR-9*靶向IRF2促进传染性法氏囊病病毒复制的分子机制为研究gga-miR-9*对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究用化学合成的方法合成gga-miR-9*的模拟物gga-miR-9*mimics,转染DF-1细胞,24 h后,接种IBDV, 48 h后,收集细胞培养上清液,测定IBDV的滴度,结果显示,gga-miR-9* mimics能够促进IBDV的复制。通过对病毒感染后的IFN检测分析,发现gga-miR-9*可负调控干扰素(IFN)的产生;进一步用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,gga-miR-9*可靶向调控干扰素调控基因2(IRF2)。用 western blot 和 qRT-PCR 分析,gga-miR-9* mimics 转染的 DF-1 细胞中IRF2蛋白和mRNA水平均比正常DF-1细胞显著降低,将细胞中的IRF2基因敲除,IBDV复制滴度((106 25TCID50/0.1mL))显著高于miRNA对照组((105 25TCID50/0.1mL)),表明细胞gga-miR-9*促进IBDV复制的分子作用机理是在IRF2基因转录后水平上抑制细胞天然免疫功能而发生的。4传染性法氏囊病病毒感染对鸡细胞模式识别受体及抗病毒基因转录的影响为研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡细胞模式识别受体(PRRs)及天然免疫抗病毒基因转录的影响,本实验分别用IBDV弱毒感染DT40细胞和强毒感染SPF鸡,以定量PCR (qRT-PCR)检测感染细胞和法氏囊组织中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5 和 LGP2)及天然免疫抗病毒基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的mRNA转录变化。在IBDV感染DT40细胞的2h到 24h 内,chMDA5、chTLR3、chLGP2、IRF3、PKR、OAS、Mx 的转录水平显著上升,分别为 324、22、61、29、16、225 000 和 18 700 倍。当用 siRNA 分别敲除 DT40 细胞中 chMDA5、chTLR3 和 chLGP2 时,IPS-1、IRF3、PKR、OAS和Mx在IBDV感染后的2h到24h差异变化不显著。在IBDV感染SPF鸡法氏囊组织细胞中,chMDA5和chTLR3的表达显著降低,而chLGP2表达没有显著差异,IRF3、PKR、OAS和Mx的转录水平显著上升。TLR4和TLR7在IBDV的体外和体内感染试验中均未检测到,而IPS-1在IBDV的体外和体内感染试验中均变化不显著。本实验结果表明,chMDA5、chTLR3和chLGP2在识别IBDV的感染中起着关键作用,IBDV感染严重抑制了鸡细胞模式识别受体chMDA5和chTLR3的转录,并且提示其抑制作用在体内与体外可能存在不同的分子机制。5 gga-miR-142-5p调控chMDA5抑制传染性法氏囊病病毒复制的机制传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒引起的一种高度危害养鸡业的传染病。chMDA5在识别病原相关分子模式(PAMPs)及激活宿主的天然免疫应答中具有重要的作用,但chMDA5识别IBDV的分子机制仍然不清楚。本研究以IBDV为模式病毒,采用体外感染模式,在IBDV感染的DT40细胞中,chMDA5的表达水平显著升高。chMDA5过表达可以抑制IBDV的复制,并激活IFN-β promoter和Mx promoter活性,chMDA5抑制表达则得到相反的结果;且chMDA5激活IFN-β promoter活性主要是通过IRF7通路;表明chMDA5可以激活鸡体的抗病毒天然免疫反应发挥抗IBDV感染作用。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3’UTR; qRT-PCR和免疫印迹分析表明gga-miR-142-5p可以使chMDA5的蛋白水平表达降低,但mRNA水平没有变化;gga-miR-142-5p过表达可以使IFN-β promoter和Mx promoter活性降低;IRF7通路被抑制,而NF-κB通路无影响,IBDV复制水平升高。本研究表明:gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3’UTR调控chMDA5的表达从而影响其下游IFN-β promoter和Mx promoter活性来发挥抗IBDV感染的作用。