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第一部分microRNA在急性白血病中的分类及预后中的作用目的：观察23种前体miRNAs在85例初发未治急性白血病中的表达,探讨miRNAs在急性白血病中分类及与预后的关系。方法：采用逆转录实时荧光定量PCR技术检测23种miRNAs在初发未治急性白血病患者骨髓单个核细胞中的表达,并对患者的生存期进行随访。结果：①16个miRNAs在85例AML与ALL中差异表达,9种miRNAs(miR-128a、miR-128b、miR-155、miR-150、miR-17、miR-29a／c、miR-29b、miR-146a、miR-20a)在ALL中表达明显高于AML,而7种miRNAs(miR-223、miR-221、miR-222、miR-27a／b、miR-23a、miR-196b、let-7b)在AML表达明显高于ALL。②32例ALL患者中miR-146a、miR-181a／c和miR-221与ALL患者的总生存期相关：miR-146a、miR-181a／c高表达的患者的生存期短,而miR-221高表达患者有更长的生存期。③5种miRNAs(miR-25、miR-26a、miR-29b、miR-146a、miR-196b)表达水平与53例AML患者生存期有显著相关。miR-25的表达水平与生存期呈正相关,另4种表达水平与生存期呈负相关。对其中的40例非M3亚型的AML病例进行分析,3种miRNAs(miR-26a. miR-29b、miR-146a)的表达水平与生存期均呈负相关。④考虑到miR-146a是我们研究的23个miRNAs中唯一一个与AML和ALL患者总生存期相关的miRNA,追加检测了61例初发未治AML患者骨髓标本miR-146a,结果显示miR-146a低表达患者生存期长。⑤通过检索国际上5个主要的miRNA靶基因数据库,我们发现miR-146a共有约7200个可能的靶基因。我们重点分析了至少3种算法都符合的622个基因。在基因本体论生物过程部分,与被预测的27901个人类可能受miRNA调控的基因相比,622个miR-146a的可能靶基因中负调控生物学过程、负调控细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞周期关卡、细胞周期停滞和DNA损害检查点相关的基因比例明显提高。高表达miR-146a的患者临床预后相对差,可能与miR-146a高表达后抑制了其靶基因表达有关。结论：①9种miRNAs(miR-128a、miR-128b、miR-155、miR-150、miR-17、miR-29a／c、miR-29b、miR-146a、miR-20a)在ALL中表达明显高于AML；而7个miRNAs(miR-223、miR-221、miR-222、miR-27a／b、miR-23a、miR-196b、let-7b)在AML表达明显高于ALL。②miR-146a、miR-181a／c高表达的ALL患者的生存期短,而miR-221高表达的ALL患者生存期长。③miR-25的表达水平与AML患者生存期呈正相关,miR-26a、miR-29b、miR-146a、miR-196b表达水平与AML患者生存期呈负相关。miR-26a、miR-29b、miR-146a的表达水平与非M3亚型的AML患者生存期均呈负相关。④在基因本体论生物过程部分,与被预测的27901个人类可能受miRNA调控的基因相比,622个miR-146a的可能靶基因中与负性调控生物学过程、阴性调控细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞周期关卡、细胞周期停滞和DNA损害检查点相关的基因比例明显提高。miR-146a高表达的患者临床预后相对差,可能与miR-146a高表达后抑制了靶基因表达有关。第二部分microRNA在高三尖杉酯碱诱导急性髓系白血病细胞凋亡中的作用机制目的：探讨microRNA在高三尖杉酯碱诱导急性髓系白血病细胞凋亡中表达变化,并初步探讨其作用机制。方法：采用MTT比色法研究HHT对K562、HL60、U937细胞的体外生长抑制作用；采用流式细胞仪PI染色检测细胞周期和Annexin V/PI双染色检测细胞凋亡；采用miRNA芯片技术检测HHT作用K562细胞后miRNA表达的变化；采用real-timePCR技术检测HHT对K562、HL60、U937细胞成熟miRNA表达的影响；采用real-time PCR技术检测HHT对K562、HL60、U937细胞及原代AML细胞miR-17-92表达的影响；采用real-time PCR技术检测HHT对K562、U937细胞C-Myc和p21mRNA表达水平的影响；采用Western Blot技术检测K562和U937细胞miR-17-92基因簇相关基因蛋白水平表达；采用Western Blot技术检测HHT作用K562细胞后bcr／abl P210蛋白和Bcl-2家族蛋白水平表达变化。结果：①HHT抑制人AML细胞株K562、HL60、U937细胞的生长,均呈浓度和时间依赖性。②HHT对K562细胞无明显的周期抑制作用,HHT能诱导K562、HL60、U937细胞凋亡,并呈浓度依赖性。③共检测了600多个人miRNAs表达变化,发现有13种miRNAs(miR-17,miR-17*,miR-18a,miR-18b,miR-20a,miR-20b,miR-93,miR-106a,miR-126,miR-142-5p,miR-144,miR-233和miR-320)在HHT作用后3个时间点均表达下调,与对照组相比差异大于1.5倍,未发现3个时间点均表达上调的miRNA。进一步通过real-time PCR验证,HHT能下调K562、HL60、U937细胞13种成熟miRNA的表达。④HHT能明显下调K562、HL60、U937和3例原代AML细胞miR-17-92基因簇的初级转录本表达。⑤HHT下调K562、U937细胞C-Myc mRNA表达,并上调p21mRNA表达。⑥HHT能下调K562、U937细胞P-AKT和c-Myc蛋白的表达,上调p21、PTEN、P-PTEN和E2F1蛋白的表达,而BIM和总AKT则无明显变化。⑦HHT作用K562细胞24h后,bcr／abl P210蛋白表达才明显下调,而促凋亡蛋白Bak、Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-1表达下调。结论：①HHT可以抑制人AML细胞株细胞的增殖并诱导细胞凋亡。②HHT能下调人AML细胞13种miRNA的成熟体表达,其下调miR-17-92基因簇1miRNA表达是先通过下调c-Myc表达,进而下调miR-17-92基因簇的前体转录本表达实现的。HHT作用24h后才明显下调K562细胞bcr/ablP210蛋白表达,说明HHT下调K562细胞的c-Myc表达可能并不通过bcr／abl P210融合蛋白。③HHT上调AML细胞miR-17-92基因簇及其两个旁系同源体的共同靶基因p21、PTEN、和E2F1蛋白表达,并抑制PTEN下游AKT磷酸化,上调p21蛋白表达可能与p21mRNA表达上调有关。这些靶基因表达上调可能与HHT下调miR-17-92基因簇及其两个旁系同源体的相关miRNAs表达有关。④HHT还可以通过上调K562细胞的Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bak、Bax表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-1表达诱导AML细胞凋亡。第三部分miR-17-92基因及miR-17、miR-20a的类似物和抑制剂转染及作用机制目的：通过基因转染进一步研究miR-17-92、miR-17、miR-20a在HHT诱导AML细胞凋亡中的作用机制。方法：通过逆转录病毒载体将miR-17-92基因转染进入K562和U937细胞；采用电转法分别将miR-17和miR-20a的模拟物和抑制剂转染进入K562细胞；采用WesternBlot技术检测相关靶基因表达变化；采用real-time PCR技术检测p21基因表达变化及miRNA表达变化；采用Annexin V/PI双染色方法检测HHT对转染后细胞凋亡影响。结果：①转染miR-17-92基因后,与对照细胞相比,K562和U937细胞的p21、E2F1和PTEN蛋白表达下调,p21mRNA表达下调。50ng／ml HHT处理转染了miR-17-92基因的K562和U937细胞24h后,与对照细胞相比,转染后细胞早期凋亡细胞比例明显下降。②K562细胞转染miR-17和miR-20a的模拟物后,与对照细胞相比,转染后p21、E2F1和PTEN蛋白表达下调,p21mRNA表达下调。K562细胞转染miR-17和miR-20a的抑制剂后,与对照细胞相比,p21、E2F1和PTEN蛋白表达上调,p21mRNA表达上调。50ng／ml HHT处理K562细胞24h后,与对照细胞相比,转染miR-17／miR-20a模拟物后K562细胞早期凋亡比例明显下降,转染miR-17／miR-20a抑制剂后K562细胞早期凋亡比例明显上升。结论：①在K562和U937细胞中,p21、E2F1和PTEN是miR-17-92基因簇的靶基因。②在K562细胞中,p21、E2F1、PTEN表达分别受miR-17和miR-20a调节,是miR-17和miR-20a的靶基因。③结合第二部分结果,说明HHT先下调了AML细胞的miR-17-92基因的表达,进而降低了miR-17和miR-20a的表达,导致靶基因p21、E2F1、PTEN表达上调,从而促进AML细胞凋亡。④提高miR-17-92、miR-17、miR-20a表达均可抑制AML细胞对HHT的敏感性；抑制miR-17或miR-20a功能可促进AML细胞对HHT的敏感性。总结：我们的研究发现在中国病人中一组miRNA—miR-223、miR-128a和miR-128b在AML和ALL中表达不同。在国际上首先发现一些miRNA的表达与急性白血病的总生存期明显相关：miR-146a、miR-181a／c高表达的ALL患者的生存期短,而miR-221高表达的ALL患者生存期长；miR-25的表达水平与AML患者生存期呈正相关,miR-26a、miR-29b、miR-146a、miR-196b表达水平与AML患者生存期呈负相关。分析miR-146a的可能靶基因,其中负性调控细胞生长和促进细胞凋亡的比例明显高于所有可能受miRNA调控的基因中相应基因比例,这可能是急性白血病高表达miR-146a预后相对差的原因之一。HHT能诱导人AML细胞凋亡并下调AML细胞13种miRNAs表达。HHT下调AML细胞miR-17-92基因簇的正向转录因子C-Myc蛋白的表达,导致miR-17-92基因簇表达下调。miR-17-92基因簇表达下调导致miR-17、miR-20a低表达。HHT通过降低miR-17、miR-20a等miRNA表达,上调了其靶基因p21、E2F1、PTEN表达,进而诱导AML细胞凋亡。因而我们认为miR-17-92基因簇及其两个旁系同源体的一些miRNAs,共同通过靶基因p21、E2F1、PTEN介导HHT诱导人AML细胞凋亡,国内外未见相关的报道。