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目的热痹清片是治疗虚热型类风湿关节炎的中成药,方中含有制马钱子。制马钱子治疗风湿病的主要有效成分为马钱子碱和士的宁,同时两者也是毒性成分。实验研究建立热痹清片中马钱子碱和士的宁的血药浓度分析方法,并以制马钱子粉为对照,研究其在大鼠佐剂关节炎(AA)模型下及正常大鼠多次给药的药动学过程,以探讨其体内的药动学规律,为热痹清片在临床上安全合理应用和开展深入研究奠定基础。方法1.热痹清片中马钱子碱和士的宁血药浓度分析方法的建立。采用高灵敏度的超高液相色谱-四极杆轨道阱高分辨质谱仪(UPLC-Q-Orbitrap HRMS),以马钱子碱、士的宁响应值及峰形作为评价指标,以盐酸克伦特罗为内标,考察质谱和色谱测定条件,优选流动相的比例和进样时间,并进行相关方法学考察。2.热痹清片中马钱子碱和士的宁在AA模型大鼠体内的药动学研究。(1)造模随机取SD雄性大鼠36只,在其右后足注射弗氏完全佐剂0.1ml进行造模,于造模后第1、3、5、8、10、12、14、15、16天测定各组大鼠足跖部肿胀体积、关节红肿程度和体重,计算足趾肿胀率、关节炎指数、增重率,初步判断造模是否成功。并在药动学实验取血完毕后,腹主动脉取血,酶联免疫法测定血清中IL-1β、TNF-α含量,并取脾脏、胸腺,应用SPSS17.0软件分析免疫器官脾脏、胸腺指数,再次验证造模是否成功。(2)分组将造模成功的大鼠,随机分为制马钱子粉模型组、热痹清片模型组,每组6只。另取健康SD雄性大鼠12只,随机分为热痹清片组、制马钱子粉组作为对照。(3)给药剂量与取血各组均按马钱子碱0.12 mg/kg的剂量灌胃给药。于给药后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min,眼眶静脉采血。采用液质法测定各给药组大鼠体内血浆中马钱子碱和士的宁的浓度。(4)实验数据处理方法采用DAS3.0软件运算马钱子碱和士的宁的药动学参数,SPSS17.0软件计算药动学参数的差异,进行t检验分析。3.正常大鼠多次给予热痹清片的药动学研究。取SD雄性大鼠随机12只,分为热痹清片组、制马钱子粉组,每组6只。按马钱子碱0.12mg/kg的剂量灌胃给予相应药物,每天给药三次,连续灌胃6天。自第三天起,每天于第二次灌胃后180、300、420min,分别对各组大鼠进行眼眶静脉取血。在第七天早上灌胃给药后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min,眼眶静脉取血,应用液质法测定大鼠体血浆中马钱子碱和士的宁的浓度,DAS3.0软件计算马钱子碱和士的宁的药动学参数。SPSS17.0软件计算药动学参数的差异,进行t检验分析。结果1.血药浓度测定方法。质谱条件:采用电喷雾离子源,选用正离子,sheath gas flow rate:10,spray voltage(KV):3.5,spray current(uA):0.3,capillary temperature(℃):320,Aux gas heater temperature:50。马钱子碱、士的宁、盐酸克伦特罗的m/z分别395.199、335.177、279.161。色谱条件:流动相30%乙腈:70%0.15%甲酸溶液,柱温35℃,流速0.2mL/min,进样量5μL,进样时间5min。马钱子碱和士的宁的线性范围分别为0.1215ng/mL、0.2430.75ng/mL,两者的平均回收率分别为84.93%、83.37%,RSD为6.06%,基质效应分别为84.92%、84.29%,RSD为3.01%。最低检测限为:马钱子碱0.06ng/mL,士的0.12ng/mL,两者的RSD分别为4.78%,4.77%。2.热痹清片中马钱子碱和士的宁在AA大鼠体内的药动学研究。制马钱子粉在正常大鼠与AA大鼠体内马钱子碱和士的宁的药动学参数的平均数分别为:Tmax为1.50、1.58h和0.32、0.28h;Cmax为2.26、3.45ng/mL和3.45、21、47ng/mL;AUC为35.7、156.56和29.65、93.82 ng·min·L-1,T1/2为6.58、6.92h和2.51、2.13h;CL/F为623339、65441L·kg-1·min-1和810118、823325L·kg-1·min-1;热痹清片在正常大鼠与AA大鼠体内马钱子碱和士的宁的药动学参数的平均数分别为:Tmax为1.50、1.50h和0.64、0.73h,Cmax为2.68、7.16ng/mL和5.27、21.57ng/mL,AUC为16.52、148.42和52.4、175.02ng·min·L-1,T1/2为4.70、5.63h和3.57、2.50h,CL/F为71250、81818 L·kg-1·min-1和91349、93217L·kg-1·min-1。AA大鼠体内马钱子碱和士的宁参数T1/2提前1.13、3.13h,Tmax提前0.86、0.77h,Cmax是正常大鼠的1.96、3.01倍,CL/F是正常大鼠的1.28、1.13倍;马钱子碱和士的宁在正常大鼠与AA大鼠体内的药动学过程均符合一室模型。热痹清片AA组和制马钱子粉AA组之间,马钱子碱和士的宁的药动学参数AUC0-t,Tmax有差异。3.正常大鼠多次给予热痹清片的药动学研究。热痹清片中马钱子碱和士的宁从第三天给药后达到了稳态。马钱子碱和士的宁的血药浓度维持在0.140.24 ng/mL,0.912.11ng/mL。马钱子碱和士的宁在两组大鼠体内的药动学过程均符合一室模型。末次给予热痹清片后马钱子碱和士的宁在的主要药动学参数分别:Tmax分别为1.50、1.08h,Cmax分别为4.46、18.74ng/ml,AUC0t分别为60.10、215.62ng·min·L-1,CL/F分别为88991、51352L·kg-1·min-1;制马钱子粉中马钱子碱和士的宁的在大鼠体内的主要药动学参数:Tmax分别为1.33、0.71h,Cmax分别为3.82、15.27ng·ml-1,AUC0t分别为47.2、129.13ng·min·L-1,CL/F分别为56182、20408L·kg-1·min-1。结论1.本实验建立的测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁含量分析方法,专属性强,灵敏度高、检测结果准确稳定,可以作为制剂中马钱子碱和士的宁的血药浓度的含量测定。2.热痹清片中马钱子碱和士的宁的药动学过程均符合一室模型,且两者在AA模型下与正常大鼠体内的药动学参数相比,热痹清片中马钱子碱和士的宁生物利用度增加、吸收增加、消除加快。制马钱子粉AA组与热痹清片AA组比较,马钱子碱和士的宁达峰时间后延,吸收量增多。说明复方中其他药味对其体内过程有影响。3.正常大鼠多次给予热痹清片,马钱子碱和士的宁在第三天第二次给药达到稳态。两者的血药浓度没有随着维持剂量的给药次数的增加而叠加递增,并且停止给药后,二种成分在体内能够迅速消除,且末次给药后两者的药动学行为均符合一室模型,提示该药物在安全剂量内几乎不会造成体内蓄积性中毒现象。制马钱子粉和热痹清片中马钱子碱和士的宁药动学参数有显著差异,说明复方配伍对制马钱子在大鼠体内的过程有显著影响。