骨髓间充质干细胞（BMSC）因其强大的增殖能力和较强的多向分化潜能，而且不涉及到伦理学问题，又具有取材方便、便于自体移植、外源性基因转染等优点，是组织工程的理想种子细胞，因此越来越受到人们关注。BMSC现在已被用于一些临床疾病的细胞移植治疗，比如骨发育不全、急慢性移植物抗宿主反应疾病、炎性肠病、缺血性心脏病、未愈合性溃疡、缺血性发作以及帕金森病等。尽管细胞治疗为许多临床疾病的治疗带来了新希望，提供了一种新的治疗手段，然而，临床研究发现移植入缺血区MSC的存活率非常低，移植24h后，大约99%的BMSC发生凋亡［1］。因此，干细胞存活率低下成为了细胞移植技术发展的关键障碍。损伤局部的缺血缺氧微环境和炎症环境（中性粒细胞和巨噬细胞是ROS最主要的来源）均能引起活性氧复合物(reactive oxgenspecieces，ROS)的释放，体内活性氧的大量堆积可以促使细胞凋亡、坏死和组织损伤。体内ROS主要包括:超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢(H2O2)等，通过激活许多信号传导通路来导致细胞损伤。为此，增强干细胞的抗氧化损伤能力是解决移植BMSC存活率低的关键问题。在氧化应激的多条通路中，mTOR（雷帕霉素靶蛋白）通路发挥着重要的作用，mTOR通路是介导细胞生长和阻止细胞死亡的重要的信号转导通路,同时参与细胞凋亡的调控[2]，研究显示mTOR信号的小分子抑制剂可以通过降低Mcl-1的表达和增加磷酸化的Bim的表达来促进凋亡。由于Bim可以直接刺激Bax和Bak的活化，并且间接的与抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1结合，Bim表达水平的上调抑制了mTOR信号通路的活化，最终导致促/抗凋亡蛋白失衡，从而发生凋亡[3]。姜黄素作为食物香料的主要成分被人们所熟知，它是一种从中药姜黄中提取的天然产物石榴籽多酚，由于其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗淀粉样变性等广泛的药理作用而被临床运用于治疗多种慢性疾病，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森疾病、多发性硬化，癫痫、脑损伤、脑损伤、糖尿病和艾滋病等，并取得一定的疗效。目前公认的姜黄素作用机理主要有：①抗氧化作用：氧化损伤是BMSCs移植治疗时所遭遇最主要的有害刺激之一。姜黄素是一种天然的抗氧化剂，其含有的酚性羟基可以直接捕获或清除自由基，其清除自由基能力甚至高于维生素②抗炎症反应：炎症反应也是造成干细胞移植损伤的原因之一。体外实验表明，姜黄素能够清除自由基，并使细胞免于脂类及蛋白质过氧化反应造成的损害。但是BMSCs在氧化损伤的环境下，姜黄素能否通过mTOR通路来发挥抗氧化应激作用未见相关报道。为此，本实验通过H2O2建立BMSCs的氧化应激模型，观察BMSCs在不同浓度的H2O2刺激下的形态学和病理学变化，采用MTT检测不同浓度H2O2对BMSCs增殖的影响。用Western blot等检测方法，探讨BMSCs在氧化应激中mTOR信号通路和凋亡蛋白的表达变化，以及姜黄素干预后中，通过调节mTOR信号通路和凋亡蛋白的变化来减轻氧化应激性刺激对BMSCs的损伤的机制。最终为细胞的抗氧化治疗提供新的实验依据和思路。第一部分：mTOR信号通路及凋亡相关蛋白在BMSCs氧化应激中的作用方法1. BMSCs分离、培养与鉴定2. BMSCs氧化应激模型的建立：实验分组：对照组（BMSCs常规培养）和氧化应激损伤组（BMSCs常规培养+100、200、300、400、500、800、1000μmol/L H2O2）损伤组（n=5）3.氧化应激性刺激对BMSCs的损伤倒置相差显微镜观察对照组和损伤组H2O2处理24h后的BMSCs的形态学改变。MTT法检测在对照组和损伤组H2O2处理24h、48h、72h小时后，H2O2对BMSCs的增殖抑制作用。荧光显微镜观察H2O2处理BMSCs24h后的hochest33342染色核的凋亡形态学改变。4. western blot检测H2O2处理BMSCs后mTOR、p70s6k、s6蛋白以及蛋白磷酸化的表达。5. western blot检测H2O2处理BMSCs后的Bax、Bcl-2蛋白表达水平。6.实验所有数据用SPSS17.0进行统计分析，组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD检验。结果1.100～1000μmol/L浓度的H2O2处理mBMSCs24h后，其形态学发生病理学的浓度依赖性改变。2. MTT检测结果显示：随着H2O2的浓度及作用时间的增加，BMSCs的死亡数量相应增加。3. hochest33342染色显示：随着H2O2浓度的增加，细胞核的凋亡形态增多，与对照组相染色结果比，H2O2浓度在500～1000μmol/L时，凋亡细胞数量显著增多。4. H2O2浓度在100～300μmol/L时，随着H2O2浓度的递增，mBMSCs的mTOR、P70S6K、S6蛋白的表达有增高的趋势，其磷酸化表达也明显增加（P﹤0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平也增加明显（P﹤0.01），凋亡蛋白Bax的表达水平不明显（P﹥0.05）。5. H2O2浓度在400μmol/L以上时，随着H2O2浓度的递增，p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、BCL-2的表达水平降低（P﹤0.05，P﹤0.01），而mTOR、P70S6K、S6表达变化不明显，同时Bax的蛋白表达明显增高（P﹤0.01）。结论氧化应激性刺激可以使mBMSCs的存活率降低，促使细胞凋亡，其机理可能与氧化损伤抑制mTOR及其下游信号通路的活性，特别是抑制蛋白的磷酸化有关；同时也与抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，增加凋亡蛋白Bax表达有关。第二部分：姜黄素在BMSCs氧化应激性刺激中的作用及机制方法:1.实验分组：1）对照组（BMSCs常规培养，不加任何额外刺激），2）氧化应激损伤组（对照组+500μmol/L H2O2），3）姜黄素组（3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L姜黄素干预），4）雷帕霉素+姜黄素组（氧化应激组+50ng/mL的雷帕霉素+12.5μmol/L姜黄素）。2. MTT法检测不同浓度姜黄素对BMSCs的抗氧化作用。3. western blot检测经各组处理后BMSCs的Bax、Bcl-2蛋白表达水平，mTOR及其下游信号通路p70s6k、s6磷酸化蛋白的表达变化.7.实验所有数据用SPSS17.0进行统计分析，组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD检验。结果1. MTT检测结果显示：在12.5μmol/L的姜黄素浓度时发挥最大抗氧化应激作用。2.12.5μmol/L姜黄素组与氧化应激损伤组相比,p-mTOR、p-P70S6K、p-S6的表达水平增高（P﹤0.01）；mTOR信号通路阻断剂雷帕霉素可以明显阻断这一作用（P﹤0.01）。3.12.5μmol/L姜黄素组与氧化应激损伤组相比,Bcl-2的表达水平上调，Bax的表达水平下调（P﹤0.01）；mTOR信号通路阻断剂雷帕霉素可以明显阻断这一作用（P﹤0.01）。结论一定浓度的姜黄素可以发挥抗氧化应激作用，其机制可能与活化mTOR通路，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，降低促凋亡蛋白Bax表达密切相关。