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牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovineviraldiarrhea-mucosaldiseasevirus,BVDV)是黄病毒科瘟病毒属(Flaviridaepestivirus)的成员,主要引起牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD),症状为腹泻,急、慢性黏膜病,持续性感染与免疫耐受,免疫抑制;母畜流产、死胎和畸形态等症状。该病主要感染牛,犊牛更易感,也可以感染其他的动物。牛病毒性腹泻病是世界范围的传染性疾病,具有较高的感染率,该病在我国二十几个省份存在,且有扩大趋势。
Erns和E2基因位于BVDV基因组5端的三分之一部分,分别编码具有抗原性的囊膜蛋白Erns和E2。两种蛋白诱导易感动物产生的中和抗体均能抵抗BVDV和CSFV感染。所以利用Erns、E2蛋白作为诊断试剂具有重要价值。
本实验将实验室已有的质粒pMD18-T-E2经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后,连接至杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上,构建成重组质粒pBlueBacHis2A-E2。同样利用DNA重组技术将E2基因连接至毕赤酵母转移载体pPIC9K上,构建成重组质粒pPIC9K-E2。
同样方法对实验室已有的BVDVErns的PCR产物克隆至pMD18-T载体上,对其鉴定后,将Erns基因连接至杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上,构建成重组表达载体pBlueBacHis2A-Erns。将其与线性化杆状病毒DNABac-N-Blue共同转染Sf9昆虫细胞中,经过三轮的噬斑筛选,获得重组杆状病毒。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表达产物的结果表明:Erns基因在杆状病毒表达系统中获得表达,表达产物大小约为30kDa,且具有良好的抗原性。
将重组质粒pBlueBacHis2A-Erns经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,Erns基因亚克隆至表达载体pPIC9K上,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-Erns。重组表达载体pPIC9K-Erns经SalⅠ线形化后,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组上,阳性转化子命名为GS115-pPIC9K-Erns。将GS115-pPIC9K-Erns在30℃条件下震荡培养,以1%的甲醇诱导,BVDVErns融合蛋白在毕赤酵母表达系统中获得表达。经SDS-PAGE分析,表达蛋白的分子量大小为37kDa左右。
本实验结果表明Erns基因在昆虫杆状病毒表达系统中充分表达,且具有良好的抗原性。这为进一步的诊断试剂盒的研制和亚单位疫苗的制备奠定了基础,同时也为研究Erns蛋白生物功能提供材料。