论文部分内容阅读
第一部分GARP+CD4+CD25+调节性T淋巴细胞在急性冠脉综合征患者中表达和功能受损目的糖蛋白A为主的重复序列的孤独Toll样受体(glycoprotein A repetitions predominant; GARP或LRRC32)为最新鉴定的一种跨膜蛋白。这种跨膜蛋白仅表达于人活化的天然调节性T淋巴细胞(nTregs)表面,且不能被炎症刺激所以诱导。同时有研究表明GARP+CD4+CD25hiFoxP3+Tregs比GARP-CD4+CD25hiFoxP3+Tregs具有更强的抑制功能。因此,GARP+D4+CD25+调节性T淋巴细胞(GARP+CD4+D25+Tregs)更适合代表人活化的nTregs,从而与诱导性调节性T细胞和活化的效应性T细胞相区分。在本部分我们将探寻各组研究对象中GARP+CD4+CD25+Tregs的数量及其抑制功能。方法经过严格筛选后招募121名患者作为本课题的研究对象。121名患者分为3组:1、健康对照组患者30名;2、稳定性心绞痛患者40名;3、ACS患者51名其中不稳定心绞痛患者21名,急性心肌梗死患者30名。所以患者均在症状发生24小时内获取外周静脉血。通过Ficoll密度梯度沉淀法获取外周单个核细胞后分选T淋巴细胞。所获得的T淋巴细胞由经TCR刺激活化后,使用流式细胞仪检测各组研究对象外周血中GARP+CD4+CD25+Tregs的比例;通过检测3H-胸腺嘛啶的摄入率来评估分选的GARP+CD4+CD25+Tregs和效应性T淋巴细胞的增殖能力;通过GARP+CD4+CD25+Tregs与自身效应性T细胞共培养后检测GARP+CD4+CD25+Tregs细胞的抑制功能;通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组患者外周血中TGF-β的含量。通过RT-PCR检测各种基因的表达。结果首先我们检测了CD4+CD25+T淋巴细胞在外周血T淋巴细胞中的比例,发现各组患者CD4+D25+T淋巴细胞是水平并没有明显的差异((P=0.36)。然而与对照组和稳定性心绞痛组患者相比,ACS组患者TCR活化刺激的GARP+CD4+CD25+Tregs的水平明显降低(6.02±1.05%,P<0.01);但是对照组(9.58±1.51%)和稳定性心绞痛组患者(9.09±1.23%)之间GARP+CD4+CD25+Tregs细胞的比例并没有明显的差异(P=0.39)。同时我们通过检测了各组患者GARP+CD4+CD25+Tregs细胞的抑制功能发现,ACS组患者的GARP+CD4+CD25+Tregs细胞抑制功能也明显受损。由于GARP+CD4+CD25+Tregs细胞的比例水平和抑制功能都降低使得ACS组患者外周血中辅助性T淋巴细胞(Th)-1和Th17的水平明显升高。结论由于ACS患者中GARP+CD4+CD25+Tregs比例和功能都严重受损,使其不能有效地维持外周免疫平衡,导致Th1和Th17细胞过度增殖,从而加剧了斑块不稳定性。第二部分血红素加氧酶-1通过上调活化T淋巴细表面GARP和LAP的表达修复急性冠脉综合症患者受损的GARP+CD4+CD25+调节性T淋巴细胞目的目前研究表明血红素加氧酶-1(H0-1)可以通过上调Foxp3的表达有效的调节适应性免疫反应。GARP作为控制人调节性T细胞Foxp3表达的重要的受体蛋白,在第一部分的研究发现GARP4CD4+CD25+调节性T细胞(GARP+CD4+CD25+Tregs)在ACS患者外周血中的比例和抑制功能严重受损。因此这部分的研究中我们将探寻H0-1对ACS患者GARP+CD4+CD25+Tregs的分化和功能的影响,并探究其可能的作用机制。方法获取经过严格筛选后招募121名患者的外周血后。通过Ficoll密度梯度沉淀法得到外周单个核细胞后分选T淋巴细胞。将所获得的T淋巴细胞由经heme和TCR处理后,使用流式细胞仪检测各组研究对象外周血中Th1、Th2、Th17、潜在相关肽(latency-associated peptide, LAP)+CD4+T淋巴细胞、Foxp3+CD4CD25+T淋巴细胞及GARP+CD4+CD25+Tregs的比例;通过检测3H-胸腺嘧啶的摄入率来评估GARP+CD4+CD25+Tregs与自身效应性T细胞共培养后检测GARP+CD4+CD25+Tregs细胞的抑制功能;通过RT-PCR检测相关基因的表达水平。结果HO-1有效修复了ACS患者中GARP+CD4+CD25+Tregs受损的抑制功能并且促进了GARP+CD4+CD25+Tregs的比例。随着GARP+CD4+CD25+Tregs比例的增加和功能的恢复,使Th1和Th17过度增殖及相关细胞因子得到控制。同时在ACS组LAP和Foxp3表达也较HO-1作用前明显上调。结论HO-1可以有效恢复受损GARP+CD4+CD25+Tregs的生物学功能。而HO-1的这种作用可能与其促进LAP在活化的T淋巴细胞上表达有关。