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多菌灵(carbendazim),又称为棉萎灵、苯并咪唑44号、BCM、贝芬替(台湾)等,为工农业上常用的苯并咪唑类杀菌剂,也是苯菌灵(benomyl)在哺乳动物体内的主要代谢产物和在环境中的降解产物。我国是多菌灵生产和使用的大国,其年产量超过10000吨,约占我国杀菌剂总量的1/4。虽然多菌灵毒性低(LD50 >5 000mg/Kg),但其降解速度缓慢,易残留。已有报道,多菌灵能引起雄性大鼠生育能力降低、睾丸萎缩和精子异常等,而其作用机制尚不明确,因此有必要进行多菌灵对雄性大鼠生殖毒性机制研究。[研究目的]通过建立Hershberger试验模型,研究多菌灵的雄激素和抗雄激素样效应,探讨多菌灵对雄性大鼠生殖毒性的作用途径和特征；通过睾丸支持细胞体外培养研究,阐明睾丸支持细胞是否为多菌灵的效应靶点；拟通过以上两部分研究初步探讨多菌灵雄性生殖毒性的毒作用机制,为今后苯并咪唑类化学物的雄性生殖毒性的深入研究、认识苯并咪唑类化学物对环境生态平衡的危害和人类生殖健康的威胁及采取有效的预防措施提供实验和理论依据。[研究方法]56只5周龄健康清洁级Wistar雄性大鼠,适应环境1周后,按Hershberger试验方法建立无内源性雄激素动物模型。将试验动物双侧睾丸切除,术后恢复7天,随机分为7组,设溶剂对照组(玉米油)、阴性对照组(丙酸睾酮+玉米油)、阳性对照组(丙酸睾酮+氟他胺)、多菌灵组(丙酸睾酮+多菌灵20/100/200mg/kg.bw)、溶剂+多菌灵组(玉米油+多菌灵200mg/kg.bw),每组8只,连续染毒10天,丙酸睾酮和氟他胺以玉米油为溶剂。各组于末次染毒24小时后,称取体重,处死大鼠,依次分离雄激素依赖组织,最后分离肝脏、肾脏组织。各组织取出后用滤纸吸去组织上的血液和组织液,立即于万分之一分析天平上称重,计算脏器系数,分析质量变化。多菌灵对睾丸支持细胞的体外培养研究采用18-20天雄性健康清洁级Wistar大鼠,通过胰酶、胶原酶二步酶消化法分离获取细胞,再通过Tris-Hcl低渗等处理进行细胞纯化,采用HE染色、瑞氏-吉姆萨染色进行支持细胞的鉴定。用MTT法进行浓度为0、0.1、1、10、100μg/ml的多菌灵对睾丸支持细胞增殖的影响观察。检测多菌灵对睾丸支持细胞波形蛋白、α-微管蛋白和β-微管蛋白的表达水平。[研究结果]1.无内源性雄激素动物模型去势手术后大鼠恢复良好,未出现伤口感染和死亡情况。动物给予受试物后均未出现明显的中毒症状。各组动物给药前初始体重、给药结束终体重量及增重与阴性对照组比较,均无统计学差异(P>0.05)。各剂量组动物肝、肾器官脏器系数与阴性对照组比较,无统计学意义差异(P>0.05)。阴性对照组大鼠雄激素依赖组织脏器系数与溶剂对照组比较,显著升高,差异有统计学意义(P<0.05；P<0.01)；阳性对照组大鼠雄激素依赖组织脏器系数较阴性对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05；P<0.01)2.多菌灵的雄激素和抗雄激素样效应研究利用建立的无内源性雄激素模型研究发现,3个多菌灵剂量组中大鼠雄激素依赖组织脏器系数,与阴性对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。溶剂+多菌灵组大鼠雄激素依赖组织脏器系数与溶剂对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),而与阴性对照组比较,均显著降低并有统计学意义(P<0.05；P<0.01)。3.睾丸支持细胞的培养、鉴定采用胰蛋白酶和胶原酶两步法分离,多次实验结果比较稳定,从每只Wistar大鼠睾丸中约可获取107个睾丸支持细胞,分离细胞成活率为95%左右。睾丸支持细胞在培养瓶中贴壁生长,胞体呈长柱状或不规则型,有多个突起,细胞核为卵圆形或不规则型,典型可见核内卫星核小体。4.多菌灵对睾丸支持细胞增殖的影响MTT结果显示,在24 h、48 h和72 h时,多菌灵0、0.1、1μg/ml剂量组对睾丸支持细胞的生长抑制率在5%以下,而10、100μg/ml剂量组对睾丸支持细胞都存在明显的抑制作用,并在72 h时表现最为明显,分别为31%和34.87%。5.多菌灵对波形蛋白、α-微管蛋白和β-微管蛋白的表达的影响免疫细胞化学结果显示,低剂量组多菌灵未明显影响睾丸支持细胞波形蛋白、α-微管蛋白和β-微管蛋白的表达,而10、100μg/ml剂量组能明显抑制睾丸支持细胞波形蛋白、α-微管蛋白和β-微管蛋白的表达。[研究结论]1.本研究参照Hershberger试验方法能够建立起稳定的无内源性雄激素动物模型,成功的动物模型可用于后续的实验研究。2.在本次给药剂量下,多菌灵对雄性大鼠雄激素依赖组织未产生影响,未发现其具有雄激素/抗雄激素样效应。多菌灵引起的雄性生殖毒性,可能不是通过干扰激素途径实现的。3.本研究通过胰酶、胶原酶二步消化法,获取原代睾丸支持细胞,经过Tris-Hcl低渗等处理纯化后,通过HE染色、瑞氏-吉姆萨染色进行细胞鉴定,证明我们获取的细胞为较纯的睾丸支持细胞,并且细胞生长良好。4.10、100μg/ml剂量组多菌灵能抑制睾丸支持细胞增殖,随着作用时间的延长,作用的程度越严重。5.10、100μg/ml剂量组多菌灵能抑制睾丸支持细胞波形蛋白、α-微管蛋白和β-微管蛋白的表达,影响睾丸支持细胞的骨架结构,睾丸支持细胞可能是多菌灵引起雄性大鼠生殖毒性的效应靶点。