急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是由多种肺内及肺外直接或间接因素导致的一种急性炎症性疾病。这种炎症反应会引起肺部的肺泡毛细血管内膜的损伤加重,导致肺泡毛细血管的渗透性增加,是临床常见的高发病率的疾病,其发病与肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophage,AM）分泌TNF-α等炎性因子,直接激活多形核粒细胞（polymorphonuclear leukocytes,PMNs）,导致肺内部失控性炎症爆发,引发ALI的发生。炎症反应的基本特征是组织酸化,局部组织的pH值轻度下降。巨噬细胞会感受炎症发生区域的pH值下降参与炎症的发生,其表面是否存在对pH下降敏感的蛋白,从而介导各种炎症反应的发生值得我们深入探讨。酸敏感离子通道1a（acid-sensing ion channels 1a,ASIC1a）是一类质子H⁺门控的酸敏感通道。多种炎症性疾病发生时,组织pH值轻度下降,ASIC1a通道会感知这种pH值的下降,加重炎症反应引起机体损伤。目前研究指出胞外酸化诱导ASIC1a通道激活,调控巨噬细胞的形成及功能,参与多种炎症性疾病的发生。另有研究表明ASIC1a通道激活可以调控脊髓巨噬细胞中炎症因子的表达,但具体机制尚不清楚,有待进一步研究。因此,深入研究ASIC1a在炎症中的作用对炎症性疾病的治疗具有十分重要的意义。内质网是Ca²⁺的储存库,当胞外Ca²⁺内流入细胞内会导致胞内Ca²⁺超载,导致内质网的蛋白质合成功能及折叠的功能均失调,激活内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）。众多研究表明,ERS通过激活NF-κB,MARK等炎症信号通路,参与调节炎症的发生发展。课题组前期研究结果发现:ASIC1a在ALI引发的炎症环境中表达升高,而ERS在ALI的发生发展中发挥重要作用。ASIC1a活化诱导胞外Ca²⁺内流,细胞内Ca²⁺稳态改变会诱发ERS。为此,本实验在课题组前期研究基础上,研究体内外炎症模型中ASIC1a对LPS活化巨噬细胞分泌的TNF-α表达的影响及其与ERS之间的关系。主要研究内容概括如下:1、ALI小鼠模型的肺泡巨噬细胞中ASIC1a及TNF-α的表达变化本课题建立小鼠ALI模型（尾静脉注射LPS）,采用支气管灌洗技术,提取支气管肺泡灌洗液,进一步支气管肺泡灌洗液中分离提取小鼠AM。制成ALI小鼠模型的肺组织切片,HE染色观察ASIC1a对肺组织病理变化的影响,观察ASIC1a对肺组织的湿干重比影响。结果显示:ALI小鼠模型成功建立,ASIC1a参与ALI的发生。采用瑞氏-姬萨姆染色对AM进行纯度鉴定,结果显示AM的纯度较高,ALI小鼠AM成功分离及培养。采用Western Blot、q-PCR和ELISA实验方法观察ASIC1a、TNF-α在AM中ASIC1a、TNF-α的表达变化,结果显示,与正常组相比,LPS组AM中ASIC1a、TNF-αm RNA及蛋白表达均显著增加。结果提示,ASIC1a参与ALI引发的炎症反应。2、ALI小鼠模型的AM中,阿米洛利（Amiloride）阻断ASIC1a后,ASIC1a、TNF-α、ERS相关蛋白GRP78、CHOP、C/EBPα的表达变化实验采用Western Blot、q-PCR和ELISA实验方法观察ASIC1a、TNF-α、ERS相关蛋白GRP78、CHOP、C/EBPα的表达。结果显示:LPS组小鼠AM中ASIC1a、GRP78、CHOP、TNF-α表达均明显升高,C/EBPα表达显著下降。提示ASIC1a通过激活ERS参与ALI引发的炎症反应。3、细胞模型使用LPS的最佳刺激浓度与最佳作用时间的筛选实验采用测定NO分泌量筛选细胞模型中LPS刺激巨噬细胞的最佳给药浓度及最佳作用时间。结果显示:LPS的最佳给药浓度为0.25μg/mL,NO分泌量最高。LPS的最佳作用时间为24 h,NO分泌量最高。提示LPS活化RAW264.7细胞最佳给药浓度与最佳作用时间为0.25μg/mL,24 h,细胞模型构建成功。4、LPS活化RAW264.7细胞对ASIC1a及TNF-α表达的影响LPS（0.25μg/mL）活化RAW264.7细胞,Western Blot、q-PCR和ELISA观察细胞模型中ASIC1a和TNF-α的表达变化。结果显示,LPS组ASIC1a和TNF-α的表达均较正常组显著升高（P<0.01）,进一步提示ASIC1a参与LPS活化RAW264.7细胞引发的炎症反应。5、LPS活化RAW264.7细胞时PcTx1对Ca²⁺浓度变化的影响采用激光共聚焦技术动态检测RAW264.7细胞内PcTx1对Ca²⁺浓度的变化的影响。共聚焦荧光图片和相对的浓度轨迹结果限显示,LPS刺激巨噬细胞,Ca²⁺荧光强度明显增强,使用PcTx1作用于巨噬细胞后,Ca²⁺荧光强度明显减弱。提示ASIC1a可以促进Ca²⁺内流。6、PcTx1/ASIC1a-ShRNA阻断ASIC1a后,LPS活化RAW264.7时ASIC1a、ERS相关蛋白、TNF-α的表达变化给予LPS（0.25μg/mL）刺激RAW264.7细胞24 h,建立体外细胞炎症模型。使用PcTx1和ASIC1a-ShRNA阻断ASIC1a后。Western Blot、q-PCR、ELISA实验方法观察TNF-α、ERS标记蛋白GRP78、CHOP及C/EBPα的蛋白及mRNA表达变化。结果发现,在PcTx1/ShRNA-ASIC1a处理巨噬细胞后,Western Blot结果显示ERS标记蛋白GRP78、CHOP的表达降低,C/EBPα表达升高。ELISA实验方法观察TNF-α表达变化,结果显示,TNF-α表达显著降低。q-PCR结果与Western Blot、ELISA结果一致。提示ASIC1a通过激活ERS参与调节体外LPS活化RAW264.7细胞中TNF-α的表达。7、CHOP与C/EBPα的相互作用采用免疫沉淀实验观察CHOP与C/EBPα的相互作用关系。结果显示,在蛋白质混合溶液中CHOP与C/EBPα存在表达。当沉淀CHOP蛋白时,C/EBPα被沉淀下来。同理,当沉淀C/EBPα蛋白时,CHOP蛋白也被沉淀下来。结果表明,CHOP与C/EBPα在细胞内有相互作用,二者可以发生结合。8、C/EBPα对TNF-α启动子活性的影响采用荧光素酶实验观察C/EBPα对TNF-α启动子活性的影响,结果显示:转染m-C/EBPα质粒,与空载体相比较,荧光素酶活性没有变化。转染TNF-α质粒,与空载体相比较,荧光素酶没有变化。当C/EBPα与TNF-α质粒共转染时,荧光素酶活性显著增强,结果提示C/EBPα可以与TNF-α的启动子区域直接结合。9、过表达C/EBPα在LPS活化RAW264.7细胞中对TNF-α的表达的影响进一步观察C/EBPα与TNF-α之间的关系,采用过表达C/EBPα质粒转染RAW264.7细胞24 h,q-PCR与ELISA实验方法观察TNF-α的表达变化,结果显示过表达C/EBPα,TNF-α的表达显著降低,结果提示C/EBPα在LPS活化的RAW264.7细胞中负调控TNF-α表达。