研究背景原发性肝癌是来源肝脏上皮组织的恶性肿瘤,是全球第五位最常见的癌症和第三位最常见的癌症死因,全世界每年约有63万肝癌新发病例而超过半数的新病例发生在中国[1],目前,外科切除和肝移植仍是最有效治疗早期阶段肝癌的方法,尽管如此,患者五年内手术部位复发率高达70%[2],而肿瘤的侵袭和转移是导致患者预后差的主要原因。严格的手术指征,肝脏捐赠者的限制和高昂的成本造成肝移植只适用于少数患者。近年来,随着高通量、高分辨的成像及实验技术的发展,长链非编码RNA(long noncoding RNA lnc RNA)与疾病发生发展机制的密切相关性逐渐显现,尤其是lnc RNA对肿瘤细胞的转移、增殖和凋亡等生物学行为的调控效应备受关注[3-5]。lnc RNA广泛存在于真核生物的细胞核与细胞质中,一般长度为200bp-100kb,缺乏开放式阅读框,不能编码蛋白质,起初甚至被认为是“转录噪音”[6-8],近年来,对lnc RNA的研究逐渐取得进展,有越来越多的证据表明lnc RNA与癌症的发生和发展密切相关。前期实验我们采用基因芯片技术在肝癌组织中筛选出一个肝癌相关新基因名为UC00lkfo,其长度为2043bp,基因编码区与α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actinα-SMA)的编码基因ACTA2发生部分重叠,应用基因组浏览器和RNAplex预测ACTA2为UC001kfo的靶基因,进一步研究发现UC001 kfo和α-SMA在肝癌组织较癌周组织中表达显著性升高,并且在不同侵袭能力肝癌细胞中的表达量不同。后在人肝癌组织及细胞模型的基础上利用RT-PCR、原位杂交、免疫组化和细胞侵袭等实验进一步证明UC001kfo是具有调节功能的长链非编码RNA,能够促进肝癌细胞的侵袭转移。总之,前期实验表明UC001kfo的靶基因为ACTA2,靶蛋白为α-SAM,UC001kfo与肝癌细胞的侵袭转移相关。为了更进一步分析UC001kfo与α-SAM的相互作用机制,我们已经采用si RNA干扰技术下调UC001kfo的表达,RT-PCR的方法检测了α-SAM的m RNA表达,采用Western Blot的方法检测了α-SAM的蛋白表达,结果两者显著相关,从m RNA和蛋白水平分别验证下调UC001kfo后α-SAM的表达减少[9].α-SMA是肌动蛋白的一种,后者以单体和多聚体形式存在。单体的肌动蛋白即球状肌动蛋白(globular actin,G-actin)。肌动蛋白的多聚体形成肌动蛋白丝即纤维状肌动蛋白(fibros actin,F-actin),肌动蛋白至少表达成6种异构形式,根据等电点的不同,将其分为分为α、β、γ三类,α分布于各种肌肉细胞中,其中α-平滑肌肌动蛋白参与细胞形态的维持,参与构成真核细胞的微丝结构,是构成细胞骨架和收缩构件的主要成分,肌动蛋白的聚合和解聚参与细胞骨架的重塑,影响细胞运动,因此,α-SMA是调节细胞运动的基础[10]。另外,a-SMA是肝癌相关肌纤维母细胞(carcinoma-associated fibroblasts CAF)的重要细胞成分,在肝癌细胞旁分泌机制作用下,癌旁组织成纤维细胞(paired peritumoral tissue fibroblasts PTF)表达a-SMA向CAF表型分化,结果PTF发生迁移和侵袭[11]。研究表明a-SMA、钙黏蛋白、波形蛋白的表达还可促使上皮细胞-间充质(epithelialmesenchymal transition,EMT)改变[12],而EMT能够通过特定程序将上皮细胞转化为具有间质表型的细胞,如使细胞失去极性、获得较高的降解细胞外基质的能力等,EMT主要参与生长发育、损伤修复、肿瘤转移和多种纤维化疾病的发生发展过程[13],以细胞黏附分子表达的减少,细胞骨架中波形蛋白(Vimentin)、平滑肌蛋白表达增加以及形态上具有间充质细胞的特征等为主要特点[14-15],是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移能力的重要生物学过程[16-17]。总之,α-SAM通过细胞骨架重塑,构成微丝和EMT的发生影响细胞迁移,是增强肝癌细胞运动能力的关键环节,在肝癌细胞转移过程中发挥重要作用。近年来,研究者对细胞核骨架的研究取得很大进展,成为细胞生物学研究的一个新的生长点,细胞核骨架是相对于细胞质骨架而言,两者共同构成细胞骨架,核骨架与DNA的复制、RNA的转录和加工、染色体的组装密切相关。肌动蛋白存在于细胞核中已被证明,可能的原因之一是由胞质肌动蛋白转运至细胞核,虽然肌动蛋白是众所周知的在细胞骨架的动态行为中发挥职能,但新兴的研究在强调肌动蛋白的新角色,一些研究已经发现肌动蛋白在细胞核活动中的功能,肌动蛋白作为核部件之一,有它自己的结构和功能的规则,比如与核基质,染色质重塑,转录和m RNA加工相关[18]。因此,α-SAM似乎参与核转录调控,可能对细胞增殖产生影响。本次研究采用过表达和si RNA干扰技术通过UC001kfo调控α-SMA的表达,使细胞骨架形态发生改变,促进肝癌细胞的转移,同时使肝癌细胞发生EMT;研究UC001kfo对肝癌细胞增殖和凋亡的调控效应。目的1.采用lnc RNA过表达和si RNA干扰技术通过UC001kfo调控α-SMA的表达,使细胞骨架形态发生改变,探讨该基因对肝癌细胞侵袭转移的影响。2.探讨UC001kfo对肝癌细胞增殖的影响。3.探讨UC001kfo对肝癌细胞凋亡的影响。方法以肝癌细胞株Hep G2为细胞模型,在37℃5%CO2灭菌培养箱中培养,适时传代;实验分组为上调实验:p CDNA3.1-UC001kfo(实验组)、p CDNA3.1(阴性对照组)、Hep G2(空白组);下调实验:UC001kfo-si RNA(实验组)、NC-si RNA(阴性对照组)、Hep G2(空白组),每组三个复孔;p CDNA3.1-UC001kfo载体前期实验已构建;采用脂质体(参照Lipofectamine2000转染试剂说明书)转染技术转染后进行如下实验:荧光拍照检测NC-siRNA-FAM的转染;RT-qpCR检测UC001kfo和α-SMA的表达;免疫组化检测细胞骨架的变化;Transwell小室实验,细胞划痕实验检测细胞侵袭迁移能力;MTT和细胞克隆形成实验检测对细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测对细胞凋亡的影响。统计学方法应用SPSS18.0统计软件分析,计量资料用均值±标准差(x±s)表示,两组定量资料比较采用t检验。以α=0.05为检验水准。结果1 RT-q PCR检测UC001kfo和SMA的表达量(1)UC001kfo:48h后UC001kfo表达量UC001kfo-p CDNA组、p CDNA组、Hep G2组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为1924.14±238.69、1.87±0.43、1.00±0.29、0.01±0.00、0.85±0.25。(2)α-SMA:48h后α-SMA表达量UC001kfo-p CDNA组、p CDNA组、Hep G2组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为6.81±1.39、0.82±0.14、1.00±0.54、0.59±0.04、1.47±0.15。T-test结果:上调实验(1)UC001kfo:48h后UC001kfo表达量UC001kfo-p CDNA组与p CDNA组和Hep G2组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。(2)α-SMA:48h后α-SMA表达量UC001kfo-p CDNA组与p CDNA组和Hep G2组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。下调实验(1)UC001kfo:h UC001kfo-si RNA组与NC-si RNA组和Hep G2组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)(2)α-SMA:UC001kfo-si RNA组与NC-si RNA组和Hep G2组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。2免疫组化IA值48h UC001kfo-p CDNA组、p CDNA组、Hep G2组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为972.53±59.10、623.11±57.66、697.98±51.29、399.03±64.47、633.94±44.44。T-test结果:上调实验:UC001kfo-p CDNA组与p CDNA组和Hep G2组比较差异均有显著统计学意义(均P<0.01);下调实验:UC001kfo-si RNA组与NC-si RNA组和Hep G2组比较差异均有显著统计学意义(均P<0.01)。3 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力的变化转染48h后UC001kfo-p CDNA组、p CDNA组、Hep G2组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为213±16.17、96±4.58、128±3.21、28±9.64、80±4.04;转染96h后UC001kfo-p CDNA组、p CDNA组、Hep G2组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为201±19.09、97±5.69、116±11.53、40±3.79、72±10.21。T-test结果:上调实验:转染48h后UC001kfo-p CDNA组分别与p CDNA组和Hep G2组比较差异均有显著统计学意义(均P<0.01);转染96h后UC001kfo-p CDNA组分别与p CDNA组和Hep G2组比较差异均有显著统计学意义(均P<0.01)。下调实验:转染48h后UC001kfo-si RNA组分别与NC-si RNA组和Hep G2组比较差异均有显著统计学意义(均P<0.01);转染96h后UC001kfo-si RNA组分别与NC-si RNA组和Hep G2组比较差异均有显著统计学意义(均P<0.01)。4细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化转染48h后距划痕24h:迁移率(%)UC001kfo-p CDNA组、p CDNA组、Hep G2组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为32.56±5.56、31.05±7.12、35.77±7.28、25.72±5.13、32.59±3.74;距划痕48h:UC001kfo-p CDNA组、p CDNA组、Hep G2组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为63.57±5.58、63.41±6.04、56.77±7.54、40.76±4.74、54.76±0.57;距划痕72h:UC001kfo-pCDNA组、pCDNA组、HepG2组、UC001kfo-siRNA组、NC-si RNA组分别为98.34±2.88、87.90±0.83、92.43±2.19、、60.98±1.41、80.34±1.05。T-test结果:上调实验:转染48h后距划痕24h UC001kfo-p CDNA组分别与Hep G2组和p CDNA组比较均无统计学意义(均P>0.05);距划痕48h UC001kfo-p CDNA组与Hep G2组和p CDNA组比较均无统计学意义(均P>0.05);距划痕72h UC001kfo-p CDNA组与Hep G2组和p CDNA组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。下调实验:距划痕24h UC001kfo-si RNA组分别与Hep G2组和NC-si RNA组比较均无统计学意义(均P>0.05);距划痕48h UC001kfo-si RNA组与Hep G2组和NC-si RNA组比较均有统计学意义(均P<0.05);距划痕72h UC001kfo-si RNA组与Hep G2组和NC-si RNA组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。5 MTT和克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化1.MTT法检测结果显示:24h时pcDNA3.1-UC001kfo组、HepG2组、pCDNA组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为0.72±0.02、0.67±0.04、0.71±0.02、0.56±0.04、0.7±0.02;48h时p CDNA-UC001kfo组、Hep G2组、p CDNA组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为1.22±0.07、1.03±0.03、1.09±0.04、0.8±0.03、0.97±0.07;96h时p CDNA-UC001kfo组、Hep G2组、p CDNA组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为1.63±0.07、1.39±0.07、1.47±0.03、1.05±0.04、1.38±0.02。T-test结果:上调实验:24h UC001kfo-p CDNA组分别与Hep G2组和p CDNA组比较均无统计学意义(均P>0.05);48h时UC001kfo-p CDNA组与p CDNA比较差异有统计学意义(P<0.05),UC001kfo-p CDNA组与Hep G2组比较差异有显著统计学意义(P<0.01);96h时UC001kfo-p CDNA组与p CDNA比较差异有统计学意义(P<0.05);UC001kfo-p CDNA组与Hep G2组比较差异有显著统计学意义(P<0.01);下调实验:24h UC001kfo-si RNA组分别与Hep G2组和NC-si RNA组比较均无统计学意义(均P>0.05);48h UC001kfo-si RNA组与NC-si RNA组比较差异有统计学意义(P<0.05);UC001kfo-si RNA组与Hep G2组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。96h UC001kfo-si RNA组与NC-si RNA组和Hep G2组比较差异有显著统计学意义(均P<0.01)。2.平板克隆形成实验结果显示:48h时克隆集落形成率(%)p CDNAUC001kfo组、Hep G2组、p CDNA组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为34.94±4.24、25.73±2.32、26.80±1.91、13.20±0.92、24.40±2.31;96h时p CDNA-UC001kfo组、Hep G2组、p CDNA组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为40.93±4.41、30.40±5.14、25.80±3.67、13.60±1.83、22.73±1.62。T-test结果:上调实验:48h时UC001kfo-p CDNA组与p CDNA组和Hep G2组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。96h时UC001kfo-p CDNA组与p CDNA组和Hep G2组比较差异有显著统计学意义(均P<0.01);下调实验:48h UC001kfo-si RNA组与NC-si RNA组和Hep G2组比较差异均有显著统计学意义(均P<0.01);96h UC001kfo-si RNA组与NC-si RNA组和Hep G2组比较差异均有显著统计学意义(均P<0.01)。6流式细胞仪检测凋亡变化转染48h后Hep G2组、p CDNA-UC001kfo组、p CDNA组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为3.5±2.36、6.3±1.15、3.7±2.76、3.83±2.46、3.53±2.28,转染96h后Hep G2组、p CDNA-UC001kfo组、p CDNA组、UC001kfo-si RNA组、NC-si RNA组分别为3.12±0.58、4.97±1.16、4.03±1.04、2.3±0.56、3.6±1.78。T-test结果:上调实验:48h、96h p CDNA-UC001kfo组分别与p CDNA组、Hep G2组比较差异均无统计学意义(均P>0.05);下调实验:48h、96h p CDNA-si RNA组分别与si RNA组、Hep G2组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论1.UC001kfo通过调控a-SMA促进肝癌细胞伪足形成,细胞骨架增多,更易于肝癌细胞的运动,进而促进侵袭转移,同时发生上皮-间质改变。2.UC001kfo促进肝癌细胞的增殖。3.UC001kfo未参与肝癌细胞凋亡的调控。