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骨缺损的治疗是骨科临床医师面临的难题之一,创伤、肿瘤切除和重建常常导致骨缺损。尽管骨组织有自我修复的能力,但是如果骨缺损的面积较大,骨组织就难以自我修复,最终导致假关节形成、骨不连和机体功能的丧失。自体骨移植是公认的金标准,它具有骨诱导、骨传导和提供成骨细胞的优点,但移植骨的大小和形状受到限制,而且往往带来供区并发症,限制其应用。同种异体骨移植也具有骨传导的作用,但可能会传播疾病和引起免疫反应。而骨水泥尽管注射方便,也不会传播疾病,但由于不具有骨再生的能力,常常导致局部骨强度降低。这些方法均存在各自的不足,难以满足临床修复骨缺损的需要。组织工程骨的出现为克服上述不足提供了新思路。它的基本思路是将活细胞体外培养增殖后,与支架材料相复合修复骨缺损。尽管组织工程骨在临床上已经应用了几十年,但依然进展缓慢,其中一个重要的原因是因为其修复骨缺损的效率不高。低强度脉冲超声波(LIPUS)是一种超过人类听阈范围的高频声波,这种声波以压力波的形式存在,可对骨和周围组织产生微型压力作用。超声波可以替代一定的外力刺激,依照Wolff’s定律其机械作用导致细胞生化性能发生改变,从而促进骨折愈合。大量的动物实验证实了LIPUS能够促进软骨相关基因的表达和软骨内骨化。体外实验表明LIPUS对骨形成和骨吸收产生显著和直接的作用。临床上,LIPUS已经被成功用于治疗骨延迟愈合、骨不连和假关节形成。既然LIPUS被广泛应用于临床刺激骨增生,而组织工程骨在修复骨缺损方面的应用又备受关注,将这两种治疗方法结合起来治疗骨缺损有可能产生更好的效果。本实验采用经LIPUS作用过的骨髓基质干细胞(BMSCs)和β-磷酸三钙(β-TCP)组成的细胞支架复合体修复兔桡骨骨缺损的方法,为评估LIPUS应用到骨组织工程上的可行性提供实验依据。第一部分:低强度脉冲超声波对体外培养的兔骨髓基质干细胞增殖能力的影响目的:研究LIPUS对体外培养的兔BMSCs增殖能力的影响。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化获取BMSCs,加入条件培养基培养后随机分为两组,一组应用LIPUS对BMSCs每天作用20分钟,另一组作为对照未予作用。通过倒置相差显微镜观察细胞增殖情况,计算细胞倍增时间、分裂指数、细胞贴壁率,绘制细胞生长曲线。结果:实验组经LIPUS作用后,BMSCs增殖能力提高,并具有统计学意义(P<0.05)。结论:LIPUS具有明显促进条件培养基中BMSCs增殖的能力。第二部分:低强度脉冲超声波对体外培养的兔骨髓基质干细胞成骨作用的影响目的:研究LIPUS对体外培养的兔BMSCs成骨能力的影响。方法:取第三代BMSCs加入条件培养基后随机分为实验组(n=7)和对照组(n=7):实验组应用LIPUS对BMSCs每天作用20分钟,对照组未予作用。通过倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况,分别于第1、2、3周后停止细胞培养,应用碱性磷酸酶(ALP)和Von Kossa染色的方法鉴定细胞成骨性能。结果:BMSCs经LIPUS刺激后,细胞形态变大,核增大,核质比减小;而对照组细胞相对扁平,折光率降低。BMSCs经LIPUS刺激1周、2周、3周后,ALP活性均较对照组明显增高(P<0.05)。LIPUS刺激3周后,实验组钙结节像素值较对照组像素值明显增多(P<0.05)。结论:LIPUS可以促进条件培养基中的BMSCs向成骨细胞转化。第三部分:低强度脉冲超声波对β-磷酸三钙与兔骨髓基质干细胞相容性的影响目的:研究LIPUS对β-TCP与兔BMSCs相容性的影响。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,分离纯化获取BMSCs,加入条件培养基和β-TCP后体外混合培养并随机分为两组,一组应用LIPUS对BMSCs每天作用20分钟,另一组作为对照未予作用。通过倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况,分别于1周、2周、3周后停止LIPUS作用,在扫描电镜下观察细胞生长情况,评估TCP与BMSCs的相容性。结果: BMSCs在两组β-TCP表面生长繁殖良好。混合培养1周、2周时,实验组TCP表面BMSCs数目较对照组明显增多,并具有统计学意义(P<0.05)。混合培养3周时,实验组TCP表面BMSCs数目与对照组相比无统计学差异(P﹥0.05)。结论: LIPUS可以提高培养早期β-TCP和BMSCs的生物相容性,而对于培养晚期TCP和BMSCs的生物相容性无明显影响。第四部分:β-磷酸三钙与兔骨髓基质干细胞构建的组织工程骨经低强度脉冲超声波作用后修复骨缺损目的:研究LIPUS影响β-TCP与兔BMSCs复合体修复骨缺损的效果。方法:从兔股骨转子窝抽取骨髓,体外培养扩增,取第三代BMSCs接种于β-TCP培养一周,分为两组,一组予以LIPUS作用,另一组作为对照。以20只成年新西兰兔为研究对象,制作双侧桡骨远端骨缺损模型。一侧桡骨骨缺损处植入LIPUS作用过的细胞支架复合体做为实验组,另一侧植入LIPUS未作用过的细胞支架复合体做为对照组。分别于术后4周、8周处死新西兰兔,通过肉眼、X线片观察骨痂生长情况,使用游标卡尺测量骨痂面积,并运用计算机图像分析骨痂的灰度密度。行组织学切片检查骨痂生长情况。结果:肉眼观察、X线片、游标卡尺测量均提示实验组骨痂较对照组生长明显增多。组织学切片显示实验组血肿机化、吸收、骨小梁和骨基质形成早于对照组。结论:在骨缺损修复早期,LIPUS对BMSCs与β-TCP复合体修复兔骨缺损有明显的促进作用;而在骨缺损修复晚期,LIPUS的作用相应减弱。