目的:研究芒柄花素和替莫唑胺联用对神经胶质瘤C6细胞的协同作用,进而探索两种药物联用抗胶质瘤的协同作用的分子机制,并建立大鼠神经胶质瘤原位模型和小鼠神经胶质瘤皮下异位模型用于后期探索两种药物联用时体内药效学。方法:(1)选用大鼠神经胶质瘤C6细胞用于研究药物的体外抗增殖作用。分别设置溶剂对照组、芒柄花素组、替莫唑胺组、联用组,通过噻唑蓝法(MTT)检测给药后对各组中胶质瘤C6细胞活力的影响;根据Chou-Talalay理论计算芒柄花素和替莫唑胺的联用指数CI,并根据CI值的大小进而获得两药最佳浓度组合。(2)采用HE染色法观察芒柄花素和替莫唑胺联合作用后与单用药相比,对胶质瘤C6细胞的形态学变化的影响。(3)采用流式细胞术比较两种药物联用与单用药相比对胶质瘤C6细胞凋亡的影响。(4)采用划痕实验和Transwell实验探索两药联用和单用相比,对大鼠神经胶质瘤C6细胞迁移能力的影响。(5)建立大鼠神经胶质瘤原位模型,为后续进一步探索体内的药效学创造实验基础:将大鼠神经胶质瘤C6细胞株悬液通过微量注射剂透过颅骨注射进大鼠脑内,建立大鼠原位脑胶质瘤模型。将麻醉后固定在立体定位仪上的大鼠头皮切开后,将注射位置定位到颅脑的左脑尾状核区域,用微量注射器将10μL的C6细胞在10分钟内缓慢注射进左脑尾状核区域,完毕后缓慢拔针,进行缝合,待大鼠清醒后,观察1周,挑选建立成功的大鼠原位脑胶质瘤模型进行给药,探究两药联用的体外药效。(6)建立小鼠神经胶质瘤皮下异位模型,为进行进一步的体内药效学研究创造基础:在小鼠右前肢下侧部位注射人源的神经胶质瘤U251细胞株悬液,建立小鼠异位胶质瘤模型。建立完毕后,观察小鼠的瘤体生长情况,选取成瘤明显的小鼠进行随机分组,用于后期的药物联用的体内药效学探索。结果:(1)芒柄花素可介导对C6细胞的抗增殖作用,并存在浓度依赖性;芒柄花素和替莫唑胺在特定的浓度范围内,联合处理神经胶质瘤C6细胞48小时后,对细胞的增殖抑制具有协同作用,且当芒柄花素浓度为80μM、替莫唑胺浓度为500μM时,两药产生的协同作用最强。(2)替莫唑胺和芒柄花素联合处理C6细胞48小时之后,芒柄花素和替莫唑胺联用组细胞的形态与溶剂对照组和两药分别单用组细胞的形态相比,发生了明显的改变,联用组中活细胞数目明显下降,且细胞变小,染色质发生浓缩现象。(3)通过流式细胞术检测,用芒柄花素和替莫唑胺联合处理C6细胞48小时之后,细胞的凋亡率明显高于溶剂对照组和两组单给药组的细胞凋亡率,p<0.05;Cleaved Caspase的结果显示,联合用药组的Bcl-2的蛋白表达水平低于对照组和两组单给药组,Bax的蛋白表达水平高于对照组和两组单给药组,联用组的Caspase-3和Caspase-9的表达水平也高于对照组和两组单给药组。(4)划痕实验和Transwell实验表明,与芒柄花素和替莫唑胺单给药相比,芒柄花素和替莫唑胺联用可增加对C6细胞迁移作用的抑制。抑制作用可以通过下调MMP-2、MMP-9这两个蛋白的表达水平来实现。(5)成功的建立了大鼠神经胶质瘤颅脑原位模型和小鼠神经胶质瘤皮下异位模型。结论:芒柄花素对胶质瘤C6细胞具有抗增殖作用,且存在浓度依赖性;芒柄花素和替莫唑胺在一定的浓度范围内联用对神经胶质瘤C6细胞具有协同作用;芒柄花素和替莫唑胺联用时可通过下调Bcl-2的蛋白表达水平、上调Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达水平来促进胶质瘤C6细胞的凋亡,通过下调MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平来抑制细胞的迁移能力;成功建立了大鼠原位脑胶质瘤模型和小鼠皮下异位瘤模型,以便于后期对芒柄花素和替莫唑胺联用协同作用的体内药效学进行研究。