目的:结直肠癌肝转移与肿瘤微环境关系密切,相互影响。转移至肝脏的肠癌细胞需要建立起适合自身生长的微环境才能生存,同时肝脏微环境中的多种细胞和非细胞成分也促进肿瘤生长。肝星状细胞(HSC)是肝脏基质中主要组成细胞之一,活化后的HSC可以分泌多种物质,包括丰富的细胞外基质成分,肝细胞生长因子、软骨寡聚基质蛋白等,从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。然而,HSC如何促进肠癌细胞肝转移的机制尚不十分清楚。因此本研究在建立肠癌肝转移模型基础上,探讨肝脏微环境中HSC与肠癌细胞肝转移之间的关系。研究方法:1、选取Caco2、RKO细胞采用脾脏注射(保脾法)法建立肠癌肝转移模型,并分离出两株肠癌肝转移细胞系Caco2-H,RKO-H;2、肿瘤细胞的COL6A3基因mRNA的表达水平应用RT-qPCR技术;3、脂质体介导siRNA转染,沉默COL6A3基因表达;4、细胞短期增殖能力(0、24、48、72小时)利用MTT检测细胞活力方法测定;5、细胞迁移能力应用Transwell法检测;6、肠癌细胞长期增殖能力利用集落形成实验检测;7、细胞与细胞外基质粘附能力应用细胞-细胞外基质粘附实验检测;8、细胞蛋白表达应用蛋白免疫印迹技术(Western Blot)检测;9、ELISA试剂盒检测细胞上清液中HGF的浓度,患者血浆中COL6A3浓度;10、免疫组化判断COL6A3蛋白在肠癌原发灶和肝转移灶表达,a-SMA蛋白在肝转移灶表达;11、网络数据库下载及数据分析;12、所有实验结果统计学处理原则:每项实验均进行3次重复,结果采用均值±标准差(±s)表示。SPSS 17.0统计软件进行t检验,P<0.05有统计学意义。13、Graphpad prism 7.0软件做图。结果:1、Caco2-H、RKO-H较Caco2、RKO裸鼠体内肝脏成瘤数目显著增加。选取肠癌Caco2及RKO两株细胞系,采取脾脏注射方式建立肠癌肝转移模型。经过4轮脾脏注射筛选后,从肝脏组织提取出Caco2-H、RKO-H两株细胞系。裸鼠体内实验证实Caco2-H、RKO-H较Caco2、RKO肝脏成瘤数显著增加p值<0.05。2、Caco2-H、RKO-H较Caco2、RKO的增殖、迁移、粘附能力增强。细胞-细胞基质粘附实验证实Caco2-H、RKO-H具有更强基质粘附能力。集落形成实验显示Caco2-H、RKO-H长期增殖能力明显增加。Transwell证实Caco2-H、RKO-H迁移能力明显增强。但MTT测定Caco2-H、RKO-H在24小时细胞短期增殖未见明显差异,说明迁移差异不是因为增殖率的差异导致的。3、Caco2-H、RKO-H发生上皮间质转化x(EMT)。显微镜下Caco2-H、RKO-H细胞形态发生改变,细胞外观变长变梭,呈现纺锤状改变,发生EMT。蛋白免疫印迹法检测提示E-cad蛋白下调,Vimentin蛋白上调,N-cad蛋白上调。同时转录因子ZEB-1、Snail、Slug也明显升高。4、Caco2-H及RKO-H细胞能够更好维持HSC活化状态。将HSC培养液更换为制备好的Caco2、Caco2-H、RKO、RKO-H细胞上清,24小时后可以看到HSC在Caco2-H、RKO-H细胞上清中保持良好生长状态,在Caco2、RKO细胞上清中生长状态差。免疫荧光实验证实Caco2-H、RKO-H细胞上清组HSC的α-SMA蛋白表达升高,同时蛋白免疫印迹显示α-SMA、Fibronectin、Collagen I蛋白高表达。裸鼠肝脏转移瘤的α-SMA免疫组化提示,在Caco2-H、RKO-H成瘤组表达更强。5、活化HSC增强Caco2、Caco2-H、RKO、RKO-H迁移、粘附、增殖能力,且对Caco2-H、RKO-H影响更大。将四株肿瘤细胞培养液更换为HSC-CM,培养4小时后肿瘤细胞形态发生改变,12小时细胞更梭长。HSC-CM作用12小时后,四株细胞迁移、粘附、增殖能力均增强,并且Caco2-H、RKO-H两株细胞上述能力增加更显著,p值<0.05。Caco2-H、RKO-H细胞系中的间质表型标志物N-cad,Vimentin蛋白表达进一步增加。6、COL6A3在Caco2-H、RKO-H中高表达。我们送检四株细胞系转录组学水平测序,将结果中Caco2-H细胞系与RKO-H细胞系显著上调的分子取交集,筛选出分子COL6A3,并在PCR及蛋白水平证实Caco2-H、RKO-H中COL6A3蛋白表达显著升高。7、Caco2-H、RKO-H细胞的裸鼠肝脏成瘤中COL6A3蛋白高表达。8、COL6A3增强肠癌细胞的迁移、粘附能力。Caco2-H、RKO-H细胞敲减COL6A3后,细胞迁移、粘附能力下降,说明COL6A3在肠癌肝转移中发挥作用。9、COL6A3参与调控Integrinαv/FAK/AKT通路发挥作用。根据细胞测序结果富集到ECM-受体相互作用,粘着斑等经典信号途径。同时生信TCGA-COAD数据集,GSEA富集结果,也同样富集出粘着斑通路。GEPIA在线网站预测COL6A3与多种整合素家族成员正相关,其中Integrinαv相关性最大。蛋白免疫印迹方法证实Caco2-H、RKO-H细胞中敲减COL6A3后,抑制Integrinαv表达,同时抑制p-FAK、p-AKT表达,而对FAK、AKT无影响。10、活化HSC上调肠癌细胞COL6A3表达,通Integrinαv/FAK/AKT通路促进肠癌细胞迁移、粘附。HSC-CM作用12小时后上述四株细胞再次送检mRNA测序,结果显示Caco2-H、RKO-H中COL6A3表达进一步升高。我们将Caco2-H,RKO-H细胞敲减COL6A3,发现细胞敲减后即使再加入HSC-CM,两株细胞的粘附、迁移能力不能够完全回复。蛋白质印迹实验证明在HSC-CM作用后,COL6A3蛋白表达随作用时间增加,12小时最大化。Integrinαv、p-FAK、p-AKT表达变化与COL6A3一致,FAK、AKT蛋白未见改变。然而在两株细胞COL6A3敲减后即使加入HSC-CM,Integrinαv/FAK/AKT通路活化不能完全回复。11、活化HSC上清中分泌的HGF可上调COL6A3,通过Integrinαv/FAK/AKT通路促进肝转移。Elisa测定HSC上清HGF表达1543pg/ml。GEPIA网站预测HGF与COL6A3显著相关。Caco2-H、RKO-H同时加入含有或者不含有HGF中和抗体HSC-CM培养12小时,HGF中和抗体部分抑制了Caco2-H、RKO-H粘附、迁移能力增强,同时也部分抑制了Integrinαv/FAK/AKT通路活化。12、肠癌肝转移患者血浆中COL6A3蛋白表达升高。38例同时性肠癌肝转移患者COL6A3(590.1±88.19pg/ml)高于21例无远处转移肠癌患者(312.7±54.84pg/ml),p<0.05。ROC曲线分析发现COL6A3的曲线下面积(AUC值)为0.6654。13、患者标本免疫组化分析显示COL6A3在肝转移灶表达高于原发灶。30对结直肠癌同时性肝转移患者标本显示COL6A3在原发灶和转移灶中间质表达无差别,根据细胞浆、细胞核表达的有/无分成7个类型,原发灶和转移灶细胞浆均有表达患者例数最多为14例。COL6A3蛋白在肝转移灶总体表达高于原发灶表达(p<0.05),其中肝转移灶的细胞核表达高于原发灶细胞核表达(p<0.05),而细胞浆表达无统计学差异。14、生物信息学分析发现COL6A3与肠癌肝转移相关,是肠癌预后不良因素。利用TCGA-COAD转录组数据和临床信息,根据COL6A3表达分为高表达组(140例)和低表达组(143例),发现COL6A3高表达与COL6A3低表达相比,患者OS和PFS均缩短,预后差,具有统计学意义。森林图结果显示COL6A3高表达,年龄,肿瘤分期均为预后不良因素。GSE22834数据集验证COL6A3在肝转移灶相对肠原发灶为高表达,且具有统计学意义。结论:1、成功建立了肠癌肝转移模型,分离出肠癌肝转移细胞系Caco2-H、RKO-H;2、Caco2-H、RKO-H较Caco2、RKO具有更强的增殖、粘附、迁移能力和裸鼠肝脏成瘤能力。3、Caco2-H、RKO-H与肝脏微环境关系更为密切,需要HSC作用下能够更好的发挥转移作用。4、COL6A3增强肠癌细胞的迁移、粘附能力,并通过Integrinαv/FAK/AKT通路发挥作用。5、活化HSC分泌HGF上调肠癌细胞COL6A3表达,通过Integrinαv/FAK/AKT通路促进肠癌细胞粘附、迁移。6、COL6A3可作为肝转移预测因子。