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第一部分慢性社会挫败应激对小鼠内侧前额叶皮层线粒体功能和形态的影响目的:线粒体是具有高度动态性的细胞器,其形态乃至功能的改变受到线粒体分裂融合动态变化的影响。在诸多神经退行性疾病的动物模型以及患者大脑中均观察到线粒体动态变化异常,并表现出功能紊乱。重度抑郁症(major depression disorder,MDD)患者的尸检结果表明,其前额皮层中存在线粒体功能障碍。提示线粒体动态变化异常可能参与抑郁症的发生。本部分基于慢性社会挫败应激模型(chronic social defeat stress,CSDS),研究抑郁敏感鼠内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)线粒体功能和形态的变化。方法:构建慢性社会挫败应激模型,造模结束后运用社会接触(social interaction test,SIT)及糖水偏好(sucrose preference test,SPT)等行为学实验评价C57小鼠的抑郁样行为;使用生物发光法检测细胞内ATP含量;JC-1荧光探针测定线粒体膜电位;DHE荧光探针检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;western blotting检测线粒体呼吸链复合体I的表达;构建腺相关病毒(AAV-Mito-7-mcherry)标记mPFC脑区线粒体,使用共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察CSDS造模后,线粒体形态的改变。结果:(1)CSDS造模引起小鼠抑郁样行为的产生。与对照组(Control:90.81±1.41%)相比,抑郁敏感鼠(Susceptible)糖水偏好率降至56.70±3.24%(P<0.001),抵抗鼠无明显变化(Resilient:91.19±3.65%)。社会接触比值由1.60±0.12降低至0.62±0.07(P<0.001),抵抗鼠无明显变化(Resilient:1.40±0.09)。在Target区的停留时间也显著下降(Control:71.30±3.52 sec,Susceptible:36.36±4.41 sec,P<0.001 vs Control,Resilient:75.02±6.35 sec)。(2)CSDS诱导小鼠mPFC脑区线粒体功能损伤。与对照组相比(1.00±0.11 nmol/μg),敏感鼠ATP含量减少至0.48±0.04 nmol/μg(P<0.001),膜电位由1.00±0.09降低至0.70±0.07(P<0.05),呼吸链复合体I表达减少(Control:1.00±0.04,CSDS:0.46±0.08,P<0.01)。神经元ROS产生增加(Control:1.00±0.11,CSDS:2.91±0.42,P<0.01)。(3)与对照组呈现出的长管状线粒体,以及高度网络化程度相比,CSDS引起小鼠mPFC脑区线粒体碎片化增加,长度缩短(Control:1.04±0.08,CSDS:0.54±0.05,P<0.01)。结论:CSDS造模诱导小鼠抑郁样行为的产生,同时引起小鼠mPFC脑区线粒体功能受损,线粒体分裂增加。提示线粒体分裂增加参与CSDS所致小鼠抑郁样行为的发生。第二部分 线粒体分裂增加对小鼠抑郁样行为的作用及机制目的:由Dnm1l基因编码的动力相关蛋白1(dynamin-related protein,Drp1)是线粒体分裂的重要调节分子。其Ser616位点磷酸化的增加促进Drp1募集至线粒体外膜引起线粒体分裂增加。近期的研究在阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)和药物成瘾等神经精神疾病中均观察到线粒体分裂增加及Drp1磷酸化水平异常升高,表明这些疾病的发生与Drp1介导的线粒体分裂增加及线粒体功能紊乱有关。本文第一部分已发现CSDS引起小鼠mPFC脑区线粒体分裂增加,但尚不明确其机制。本部分以Drp1为切入点,研究线粒体分裂增加对小鼠抑郁样行为的作用及机制。方法:构建CSDS和阈下社会挫败应激(subthreshold social defeat stress)模型,造模结束后运用SIT及SPT等行为学实验评价C57小鼠的抑郁样行为;应用western blotting技术检测CSDS敏感鼠的不同脑区中Drp1及其磷酸化蛋白的表达水平;使用病毒标记mPFC脑区线粒体,并采用免疫荧光的方法标记该区域中的Drp1,观察CSDS造模后Drp1向线粒体的募集;分别采用Mdivi-1抑制mPFC脑区Drp1活性,同时构建沉默和过表达Drp1的慢病毒,以脑立体定位的方式注射至mPFC脑区,检测其对小鼠的抑郁样行为的作用,并应用免疫荧光的方法观察Drp1抑制剂Mdivi-1对Drp1向线粒体的募集,以及ROS释放的影响;采用western blotting检测沉默mPFC脑区Drp1对GluA1膜表达的影响。结果:(1)western blotting实验表明,与对照组(Control:1.00±0.04)相比,CSDS敏感鼠mPFC脑区Drp1磷酸化水平增加(Susceptible:1.33±0.08,P<0.01),抵抗鼠无显著性变化。Drp1总蛋白的表达无显著性改变。(2)CSDS不影响小鼠伏隔核(nucleus accumbens,NAc)与海马脑区中Drp1磷酸化以及总蛋白水平。(3)与对照组(1.00±0.04)相比,CSDS增加小鼠mPFC脑区Drp1与线粒体共定位(CSDS:1.48±0.15,P<0.05),即Drp1从胞浆募集至线粒体外膜的数量增加。(4)Mdivi-1抑制mPFC脑区Drp1活性,改善CSDS所致小鼠抑郁样行为。与CSDS+Vehicle组(0.38±0.10)相比,CSDS+Mdivi-1组社会接触比值增加至1.38±0.16(P<0.01),在Target区停留时间由21.33±7.42 sec增加至77.85±12.19 sec(P<0.001)。糖水偏好率由35.00±8.17%增加至87.23±4.26%(P<0.001)。并且Mdivi-1减少CSDS敏感鼠mPFC脑区Drp1向线粒体的募集。(5)western blotting实验证明Drp1沉默病毒(LV-Dnm1l-RNAi)有效下调Drp1的表达(LV-GFP:1.00±0.10,LV-Dnm1l-RNAi:0.42±0.02,P<0.01)。(6)LV-Dnm1l-RNAi下调mPFC脑区Drp1的表达改善小鼠抑郁样行为,与CSDS+LV-GFP组(0.55±0.10)相比,CSDS+LV-Dnm1l-RNAi组社会接触比值增加至1.35±0.17(P<0.001),Target区停留时间由31.69±5.99 sec增加至54.26±5.50 sec(P<0.05)。(7)过表达mPFC脑区Drp1增加小鼠的应激易感性。表现出社会接触比值显著性降低(Stress+LV-GFP:1.36±0.21,Stress+LV-Dnm1l:0.83±0.13,P<0.05),Target区域停留时间减少(Stress+LV-GFP:60.33±4.36sec,Stress+LV-Dnm1l:39.54±7.85 sec,P<0.05)。(8)Drp1在mPFC脑区多表达于神经元。Drp1抑制剂Mdivi-1减少CSDS敏感鼠mPFC脑区神经元ROS的产生(CSDS+Vehicle:1.00±0.04,CSDS+Mdivi-1:0.52±0.11,P<0.05)。(9)与对照组相比(1.00±0.06),CSDS降低小鼠mPFC脑区GluA1的膜表达(0.49±0.04,P<0.05),下调小鼠mPFC脑区Drp1的表达改善CSDS所致膜表达的下降(CSDS+LV-Dnm1l-RNAi:1.03±0.25,P<0.05 vs CSDS+LV-GFP),而GluA1总蛋白无明显变化。结论:CSDS增加小鼠mPFC脑区Drp1的活性,促进该蛋白从胞浆募集至线粒体外膜,引起线粒体分裂增加。过表达mPFC脑区Drp1增加小鼠的应激易感性。Mdivi-1抑制mPFC脑区Drp1的活性改善小鼠抑郁样行为,同时减少mPFC脑区ROS的产生。下调mPFC脑区Drp1的表达改善小鼠抑郁样行为,同时减少CSDS引起的GluA1下膜。以上结果表明,Drp1过度激活导致线粒体分裂增加,引起线粒体功能紊乱,进一步损伤谷氨酸能突触传递,引发抑郁样行为。