迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)隶属于肠杆菌科，爱德华氏菌属，是一种革兰氏阴性细菌，呈短杆状，兼性厌氧，具鞭毛及运动性。迟缓爱德华氏菌是水产养殖生物的常见致病菌之一，给水产养殖业带来了巨大的危害，对该病的及时诊断有利于降低损失。抗体的快速检测有助于疾病的早期预警及疫苗免疫效果的评价。目前常见的抗体检测方法，如中和试验、免疫凝集试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、抗体芯片技术、PCR技术、荧光定量PCR技术等均费时费力，本研究拟采用胶体金免疫层析原理制备迟缓爱德华氏菌抗体检测试纸，以期得到一种准确、灵敏、安全、花费低、快速的抗体检测方法。1.鲆鲽类8种常见致病菌灭活疫苗及其抗血清的制备本研究采用甲醛灭活迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，用灭活菌液与弗氏佐剂等体积混匀并乳化后制得各菌灭活疫苗，通过肌肉注射免疫大菱鲆获得各菌的抗血清，大菱鲆接种迟缓爱德华氏菌灭活疫苗后，采用酶联免疫吸附试验测定抗血清，从第四周开始能检测出机体抗体，到第十周抗体水平达到最高，效价为1:102400，其他各菌灭活疫苗获得的效价分别为1:6400、1:6400、1:12800、1:12800、1:6400、1:6400、1:12800。各菌与各抗血清的交叉反应试验结果显示各菌与除自身外的抗血清存在一定的交叉反应，但与自身抗血清反应最为强烈。以上实验结果表明本实验制备的抗血清可以用于检测本研究拟研制的试纸条的灵敏性与特异性。2.大菱鲆免疫球蛋白IgM单克隆抗体的制备与鉴定本研究以纯化的大菱鲆血清免疫球蛋白IgM免疫小鼠，应用细胞工程的方法生产融合的杂交瘤细胞，经免疫学检测筛选方法筛选出分泌大菱鲆免疫球蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞，制备出大菱鲆IgM单克隆抗体。采用免疫印迹及酶联免疫吸附方法对单抗的效价、灵敏性及特异性进行检测，结果显示单抗识别纯化的大菱鲆IgM重链区，单抗与半滑舌鳎及草鱼、鲤鱼、鳙鱼、鲫鱼四种淡水鱼类无交叉反应，与鲈鱼、六线、黑鮶、红鳍东方鲀、牙鲆五种海水鱼类血清有一定的交叉反应，但与大菱鲆的血清的反应最为强烈，效价为1:1.024×106，对纯化大菱鲆免疫球蛋白的灵敏度为32ng/ml，表明该单抗具有良好的灵敏性和特异性，可以用于试纸条的制备。3.抗迟缓爱德华氏菌抗体胶体金检测试纸条的研制及应用采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，通过肉眼观察及紫外分光光度计扫描，制备的胶体金颗粒均一，直径为30nm。将胶体金调至弱碱性，用制备的胶体金标记单抗，最佳标记浓度为10μg/ml，并采用Dot-Elisa法检测金标抗体，结果显示金标抗体能与抗迟缓爱德华氏菌抗体反应。用X-only单向喷点仪将金标抗体均匀喷洒于用10%牛血清白蛋白处理过的玻璃纤维素膜上，干燥后制得金标垫。同时用喷点仪将迟缓爱德华氏菌破碎液上清及葡萄球菌A蛋白分别点射于硝酸纤维素膜(NC膜)上形成检测线和对照线，组装成试纸条。对所研制的迟缓爱德华氏菌抗体检测试纸条进行重复性、稳定性、特异性及灵敏度检验试验，并与ELISA结果对比。结果显示阳性与阴性的符合率均为100%，且稳定性好，特异性高，对制备的迟缓爱德华氏菌抗血清灵敏度为1:102400，与ELISA的结果一致，并且试纸条与溶藻弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、哈维弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌抗血清均不发生交叉反应。试验证明迟缓爱德华氏菌抗体检测试纸条的检测效果与ELISA水平相当，检测试纸条具有特异性强、敏感性高、高效便捷、操作简单、易于推广等优点。