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幽门螺杆菌是导致人类多种消化道疾病的致病原,有广泛地传染性,临床难以进行彻底的治疗,利用免疫保护是预防和治疗幽门螺杆菌感染的重要方法。目的为研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶A亚单位的免疫原性和交叉免疫保护作用,本实验克隆了幽门螺杆菌26695菌株尿素酶A亚单位编码基因ure A;构建原核表达载体,表达并纯化了ureA蛋白；用纯化蛋白免疫家兔,制备抗血清,研究抗体特异性和交叉免疫保护作用。为进一步探讨ureA蛋白免疫保护作用及单克隆抗体用于治疗或预防幽门螺杆菌引发的相关疾病奠定基础。方法(1)用PCR方法从幽门螺杆菌26695菌株基因组中扩增ureA基因片段；并将其克隆至pMD18-T Vector上,转化大肠杆菌DH5α,进行鉴定；再将目的基因引入pBV220-ILl表达载体中,构建pBV220-IL1-ureA表达重组载体,进行表达载体鉴定、基因序列测定和生物信息学比对。(2)温度诱导含重组载体pBV220-ILl-ureA的工程菌DH5α,表达目的蛋白；SDS-PAGE分析ureA蛋白表达结果；Western-blotting进行目的蛋白的鉴定；胶制备法大量分离纯化蛋白。(3)将纯化蛋白与弗氏佐剂混合免疫家兔,制备抗血清；ELISA法检测家兔抗血清效价及与免疫原蛋白UreA蛋白的结合特异性；利用竞争性结合实验鉴定兔抗血清与病人阳性血清交叉保护作用。结果(1)PCR特异性扩增获得全长714bp目的片段,测序后与GenBank数据库比对,确定目的片段为幽门螺杆菌26695菌株ureA基因序列,同源性高达99%。(2)获得pBV220-IL1-ureA原核重组表达质粒,工程菌经42℃热诱导,获得包涵体表达的ureA蛋白,融合蛋白分子量约为41kD,胶制备法获得了大量纯化蛋白,浓度约为1.Omg/mL。(3)将纯化的ureA蛋白用于家兔免疫,获得家兔抗血清,效价为1：1.28×104。ELISA法检测家兔抗血清与病人抗血清具有良好的竞争性。结论(1)成功构建了pBV220-ILl-ureA重组质粒,插入序列经测序证实正确,无移码现象,与GenBank公布的基因序列高度同源。(2)成功表达并纯化了ureA蛋白,且其具有良好的免疫原性,为动物免疫奠定基础。(3)所获家兔抗血清与ureA蛋白具有良好的特异结合性。(4)竞争性实验显示,兔抗血清和人阳性血清具有交叉反应,能够产生竞争性的免疫保护作用。这为利用ureA多抗或单抗进行免疫预防和治疗幽门螺杆菌感染导致的疾病奠定了实验基础。