目的: 心功能衰竭的早期诊断与干预在心脏疾患的诊治中非常重要。脑钠肽(BNP)作为一种主要来源于心室肌细胞的循环激素,在心室壁张力升高时迅速、大量分泌,其血浆浓度与心功能的相关性已被广泛认识。但目前国内检测BNP浓度靠进口国外的各种不同试剂盒,每种试剂盒检测范围及参考值不同,结果亦不尽相同,缺乏可比性,且价格昂贵。为使BNP检测国产化,本研究制备了BNP单克隆抗体,初步用于正常人及心脏病患者的血浆BNP浓度检测,以评价自制BNP单抗检测所得的BNP浓度与心功能的关系,为进一步研制国产BNP单抗试剂盒奠定基础。 方法: 1.根据GenBank中检索到的人BNP成熟蛋白序列,拼接BNP的基因。以原核表达系统pET32构建pET32a.BNP重组质粒,经诱导提取纯化,制备人Trx-BNP融合蛋白。 2.以Trx-BNP融合蛋白作抗原,免疫小鼠,获得分泌BNP抗体的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔,进行BNP单克隆抗体的大量制备。检测杂交瘤细胞的培养上清抗体效价及腹水抗体效价。以Western blot及免疫组化检测制备的BNP抗体特异性。 3.用制备的BNP单克隆抗体以ELISA间接法检测正常人及各级心功能的心脏病患者的血浆BNP浓度。正常人20例,心脏病患者92例,后者按纽约心脏病学会(NYHA)心功能分级分为:心功能Ⅰ级(24例)、Ⅱ级(23例)、Ⅲ级(20例)、Ⅳ级(25例),同时经超声心动图评价心脏收缩(EF值)及舒张功能(E/A值)。将心脏功能与BNP浓度作相关性分析,数据进行统计学处理。 结果: 1.利用原核表达系统pET32成功构建了pET32a.BNP重组质粒,并制备出高纯度的人Trx-BNP融合蛋白。 2.以Trx-BNP融合蛋白作抗原成功制备BNP单克隆抗体。抗体效价高,特异性强。