胃癌与腹膜转移中差异表达micRNA的筛选及目的基因的功能验证

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:ewenxj860411
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【研究背景】恶性肿瘤是近年来严重威胁人类健康与生命的主要疾病,是世界范围内较为棘手的问题,人人谈癌色变。胃癌的患病率更是位居各种恶性肿瘤之二,仅次于肺癌,每年死于胃癌的人数多达近60万,主要是因为其发病率很高但早期诊治率却很低。大约2/3的病人在发现或者明确诊断之前已经发生了远处转移,这样就造成了手术机会的丧失和病人生活质量的下降,中晚期发生转移的患者5年生存率低于15%,其中发生腹膜转移是胃癌患者死亡的主要原因之一。胃癌腹膜转移过程由一系列先后发生的独立事件所组成,是多种分子在多种作用途径上,经过多步骤所起到的不同作用,随着科学技术的进步与发展,胃癌腹膜转移基因的调控在胃癌及腹膜转移的发生发展过程中所起的作用被研究人员逐步认识。基因技术的蓬勃发展为阐明各种肿瘤发生发展的分子机制带来了希望。然而,对单个基因的研究并不能阐明胃癌腹膜转移的通路,并且不能找到分子间相互作用的方式。找到胃癌腹膜转移过程中有差异表达的基因,验证它们在胃癌腹膜转移发生过程中的作用,进而研究获得大量分子间的相互作用可能在胃癌腹膜转移或者所有恶性肿瘤发生机制上都会有所帮助,高通量筛选方法为多方面理解腹膜转移的机制带来了新的机会,目前研究肿瘤转移的高通量筛选方法从策略上来说基本分为基因差异表达与表型依赖的筛选,基因差异的筛选最经典的是基因芯片技术,应用此方法已经发现了很多在肿瘤原发灶和转移灶中表达差异的基因,这些基因如何调控转移过程还需要进一步深入研究。近年来microRNA与肿瘤的发生,发展,转移,侵袭等调控机制关系非常密切,目前将肿瘤转移的高通量筛选等技术综合运用到腹膜转移机制的研究尤为重要。【目的】1.筛选出胃癌细胞GC9811和腹膜高转移细胞系GC9811-P中有差异表达的miRNA并分析验证差异倍数,筛选出可能与腹膜转移有关系的基因作为研究的目的分子;2.研究目的分子miRNA-21-5p和miRNA-146-5p的功能,探索其在胃癌及腹膜转移过程中的作用。【方法】1.细胞培养、总RNA提取:取同一时间复苏,相同条件下培养的细胞GC9811和GC9811-P对数生长48后提取总RNA,检测总RNA的OD值在1.8-2.0之间时用干冰冷冻送公司做细胞GC9811和GC9811-P的miRNA微阵列筛选差异表达的miRNA;用SPSS软件分析做出miRNA差异表达图谱;2. RT-PCR的方法验证目的基因在细胞GC9811和GC9811-P中的表达差异情况,并用2-ΔΔCt法计算相对值,选U6作为内参对照;3.病毒包装与转染:做阴性对照病毒及目的基因下调的病毒包装,选取亲本细胞系GC9811做病毒转染干扰目的基因的表达;4.用RT-PCR及免疫荧光检测的方法验证阴性对照及目的分子miRNA-21-5p和miRNA-146-5p的下调病毒转染细胞GC9811的效率和转染后两种目的分子的表达情况;5.迁移实验和侵袭实验验证目的基因对胃癌细胞GC9811转移能力的影响;6.用生物信息学的方法检测目的基因作用的靶基因。【结果】1.通过miRNA微阵列技术的筛选,统计检验和聚类分析: GC9811和GC9811-P之间存在差异的miRNA共有153个,其中在GC9811-P中表达下调的有79个,表达上调的有74个,其中信号强度大于500且P值小于0.01的共有8个,P值小于0.05的有42个,P值小于0.10的共有19个;2.我们利用RT-PCR的实验方进一步验证了信号强度大于500,P值小于0.01的8个分子,其差异表达与miRNA微阵列服务技术的筛选结果一致;3.将阴性对照病毒、miRNA-21-5p下调病毒和miRNA-146a-5P下调病毒转染进细胞GC9811中,分别标记为GC9811-NC, GC9811-21-IH和GC9811-146a-IH,用免疫荧光的方式检测三种病毒转染成功;4. RT-PCR实验证明GC9811-21-IH和GC9811-NC相比其miRNA-21-5p的表达确实下降, GC9811-146a-IH和GC9811-NC相比其miRNA-146a-5p也表达下调;5.体外侵袭及转移实验证明目的分子miRNA-21-5p和miRNA-146a-5p下调表达基因和阴性对照基因转染进入胃癌细胞GC9811中后,转染目的基因病毒的GC9811-21-IH,GC9811-146a-IH细胞比转染阴性对照病毒的GC9811-NC细胞转移数多。【结论】1.胃癌细胞GC9811和腹膜高转移细胞系GC9811-P之间存在差异的miRNA共有153个,其中在GC9811-P中表达下调的有79个,表达上调的有74个。2. MiRNA-21-5p和miRNA-146a-5p通过不同靶基因、不同信号通路抑制胃癌细胞GC9811发生侵袭及迁移。
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