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目的传统中药物质成分复杂,质量难于控制,药效物质作用机制难以证明是目前中药国际化的重大难题。随着现代中药的发展进程,以“物质基础基本清楚”、“作用机制基本清楚”为原则的组分中药研究成为新的热点,并己初步建立了“标准组分、组效关系、组分配伍、优化设计”的组分中药研发模式。前期研究结果证实,荭草苷具有一定的抗心肌缺血缺氧/复氧损伤作用,本研究以荭草苷为关键成分进行组分设计,探寻“试验设计-建立模型-多目标优化”的组分优化方法,探究“以荭草苷为关键成分的组合药物比单个成分在心肌缺氧/复氧模型上的保护作用更好,且组合药物抗MIRI作用机制与调控自噬相关”的假说,为组分优化研究提供方法学上的参考及实验依据。方法与结果1.筛选进入组分优化的成分首先,研究前期对含荭草苷的植物的调研,通过约束成分筛选条件:①黄酮类成分;②与荭草苷共同存在在同一植物中;③有抗氧化、抗炎等相关药理作用研究报道。据此初步选出槲皮苷、牡荆素、槲皮素、木犀草素、异荭草素五个成分。第二步,采用CCK-8法检测各成分对H9c2细胞存活率的影响。第三步,采用三气培养箱混合气体法建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,通过CCK-8法和LDH法研究各成分对H9c2缺氧/复氧损伤细胞存活率、损伤率的影响。实验结果提示:荭草苷(0～200 μM),槲皮苷(0～200 μM),牡荆素(0～80μM),异荭草苷(0～200μM)孵育36 h内对H9c2细胞增殖无明显影响;除异荭草苷外,荭草苷、槲皮苷、牡荆素均能显著性下调细胞损伤率。因此,荭草苷(0～50μM)、槲皮苷(0～40μM)、牡荆素(0～24μM)为最适合后续均匀试验设计的组分及浓度范围。2.基于“UD-SR-SA”法的组分优化方法研究及其实验验证本实验通过均匀设计得到荭草苷、槲皮苷、牡荆素的不同配比组合,通过药效学实验分别进行检测:①利用CCK-8法检测各配比对H9c2缺氧/复氧损伤模型细胞存活率的影响;②采用LDH法检测细胞损伤率;③检测培养基中NO含量。基于上述药效学实验结果,利用R语言建立逐步回归模型,得到综合药效与荭草苷、槲皮苷、牡荆素给药剂量之间的三元二次方程式。基于模拟退火算法理论,用python编程解出当综合药效最佳时各成分的给药浓度,即最佳配比组合OQV-e。最后,对OQV-e进行药效学实验验证。结果发现:最佳配比组合能显著提高H9c2心肌细胞存活率,降低细胞损伤率,降低NO含量,且最佳配比组合比荭草苷、槲皮苷、牡荆素单个成分降低细胞损伤率效果更明显(P<0.05),说明相较于单个成分,最佳配比组合表现出更优异的抗MIRI药效。3.OQV-e对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制探讨通过光镜下观察细胞形态发现,最佳配比组能明显改善受损的H9c2细胞状态。通过Western Blot法检测H9c2细胞内LC3、Beclin 1、p-JNK、JNK、的蛋白表达水平,评价最佳配比对缺氧/复氧损伤H9c2细胞内JNK通路及细胞自噬的影响。结果发现:与模型组相比,最佳配比组p-JNK/JNK的比值降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著性降低,Beclin 1的表达水平明显升高(P<0.05),说明最佳配比组合能够抑制JNK信号通路,抑制过度自噬,进而达到保护缺氧/复氧损伤心肌的目的。结论:1.结合文献调研与初步药效实验结果,选择荭草苷、槲皮苷、牡荆素进行组合药物设计;2.采用均匀设计为试验设计方法,以H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤为实验研究模型,逐步回归分析为建模准则,模拟退火算法为计算理论,计算出最佳配比组合OQV-e,即荭草苷12.55 μM、槲皮苷39.99μM、牡荆素19.223.3.OQV-e抗MIRI的良好药效可能是通过抑制JNK信号通路,抑制过度自噬,进而达到保护缺氧/复氧损伤心肌的目的。