多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一种溴代阻燃剂,广泛应用于纺织品、家具、电子和电器产品中。过去的数年里,PBDEs因在环境和人体中含量显著增加而备受关注。2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether, BDE47)是人体、野生动物和环境中含量最多的PBDEs同系物。研究表明,BDE47对受试动物具有发育毒性、生殖毒性、神经毒性和内分泌干扰毒性。人群研究也表明,人血浆中BDE47的浓度与精子运动能力呈负相关,提示BDE47暴露可能损害雄性生殖功能。生物转化是外源化学物在体内的重要过程,尤其是亲脂性化学物。研究显示,BDE47可被细胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP450)(尤其是CYP3A)代谢生成一系列代谢产物,但其在BDE47与生殖毒效应的关系中的作用尚不明了,其分子机制也不清楚。本研究通过建立整体或体外BDE47染毒模型,以地塞米松(dexamethasone, DEX, CYP3A1的诱导剂)为工具药物,通过评估BDE47对CYP3A1的诱导,鉴定其主要代谢产物及活性,分析睾丸生精小管上皮组织形态改变及生殖细胞凋亡,明确BDE47导致生殖细胞凋亡中的关键信号通路,侧重探讨CYP3A1在BDE47所致睾丸毒效应中的作用及分子机制。此外,通过建立高脂饮食(high fatdiet,HFD)条件下BDE47整体染毒模型,评估HFD对BDE47体内分布、代谢的影响,分析其对血糖、胰岛素、睾酮分泌的影响,探讨BDE47与高脂饮食对CYP3A1的影响及联合毒效应,阐明糖脂代谢紊乱与睾丸毒效应的关系及分子机制。研究结果将为化学物的生殖毒理学研究提供新的视角和技术支撑,也为环境污染物的生殖风险评估、危害控制及预防提供重要参考。第一部分：CYP3A1的诱导对BDE47所致大鼠睾丸毒效应的影响及分子机制目的：探讨CYP3A1在BDE47的生物转化及其导致的睾丸毒效应中的作用及分子机制。方法：建立BDE47经口灌胃染毒模型,以DEX(CYP3A1的诱导剂)为工具药,通过分析CYP3A1的表达及活性,检测血浆、肝脏、睾丸中BDE47的羟基化代谢产物,探讨CYP3A1介导的BDE47的生物转化作用；采用流式细胞仪分析BDE47及主要代谢产物3-OH-BDE47对生殖细胞凋亡的影响。此外,运用光镜在形态上观察睾丸生精上皮的破坏,分析生精小管上皮中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成与生精细胞凋亡的关系,明确关键信号通路在BDE47导致生殖细胞凋亡中的作用,从而较系统地探讨CYP3A1在BDE47所致大鼠睾丸毒效应中的作用及分子机制。结果：与溶剂对照相比,BDE47能显著升高大鼠肝脏中CYP3A1的表达及活性,3-OH-BDE47是BDE47的主要代谢产物,且其在血浆、肝脏、睾丸中的含量随着染毒剂量的增加而增加；DEX与BDE47联合处理上述效应显著增强。此外,随着BDE47染毒剂量的增加,大鼠睾丸中的3-OH-BDE47及ROS含量逐渐增加,DEX与BDE47联合处理3-OH-BDE47及ROS含量显著增加。与BDE47比较,3-OH-BDE47处理GC-1或者GC-2细胞能产生更多的ROS并通过上调FAS/FASL, p-p53和cleaved-caspase3介导细胞凋亡,抗氧化剂作用可明显降低ROS的生成及细胞凋亡。此外,BDE47染毒大鼠生精上皮出现空泡化、生精小管中多核巨细胞增多、TUNEL阳性的生精细胞数目增加、每日精子生成量下降,并呈现剂量依赖关系,而上述效应同样也被DEX的联合处理所加强。第二部分：高脂饮食条件下CYP3A1对BDE47所致大鼠睾丸毒效应的影响及分子机制目的：分析高脂饮食对BDE47体内分布、代谢以及CYP3A1诱导的影响,探讨CYP3A1在BDE47导致的糖脂代谢异常与睾丸毒效应关系中的作用及分子机制。方法：建立在正常饮食(normal diet, ND)或高脂饮食(high fat diet, HFD)条件下BDE47整体染毒模型,运用GC-MS检测血清、肝脏、睾丸中BDE47及其代谢产物,通过检测血清中葡萄糖、胰岛素、睾酮水平以及肝脏病理学改变来评估BDE47染毒对机体糖脂代谢的影响,运用光镜在形态上观察睾丸生精上皮的破坏及附睾中精子密度,采用免疫印迹检测睾丸中睾酮合成、胰岛素受体相关信号分子的表达,探明高胰岛素血症对Leydig细胞睾酮合成的分子机制。结果：HFD能促进BDE47在体内的蓄积,其代谢产物含量也显著增加；BDE47对CYP3A1的表达具有诱导作用,免疫组化进一步证实,这种诱导效应可被HDF所加强。与对照组相比,BDE47能使大鼠血糖、胰岛素水平升高、肝脏细胞出现脂肪化,BDE47染毒导致大鼠血清睾酮水平显著下降、生精上皮出现空泡化、生精小管中多核巨细胞增多,HFD组上述效应更为显著。BDE47染毒能显著提高大鼠肝脏中肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-alpha, TNFa)的表达,HFD也能显著上调TNFa的上调,BDE47与HFD联合处理,TNFα的表达进一步增加。进一步研究发现,BDE47能显著下调睾丸中IRS-1、IRβ GLUT-2、GLUT-8的表达；HFD与BDE47联合处理IRS-1、IRβ、GLUT-2、GLUT-8进一步下调。此外,BDE47能显著下调睾丸中类固醇激素合成相关蛋白,StAR、3β-HSD的表达；此外BDE47能显著上调DAX-1的表达,提示BDE47能通过上调DAX-1的表达抑制StAR、3β-HSD的表达,从而使血清睾酮浓度降低,附睾中精子密度降低。结论本次研究成功地构建了成年雄性SD大鼠的BDE47/DEX、BDE47/HFD染毒模型,分别从环境化合物的生物转化及内分泌干扰角度出发,探讨BDE47对雄性生殖内分泌功能的影响及其分子机制,获得了一些新的发现：1.BDE47能显著诱导CYP3A1的表达,CYP3A1是大鼠体内BDE47的主要代谢酶,3-OH-BDE47是主要的活性代谢产物。2.BDE47可以使雄性SD大鼠血清睾酮水平降低、生精小管中ROS含量显著上升、生精细胞发生凋亡；CYP3A1诱导条件下,BDE47所致的睾丸毒效应明显,提示CYP3A1在BDE47导致的生殖功能障碍中发挥了重要作用。3.高脂饮食可增强BDE47对CYP3A1的诱导作用,这不仅能促进BDE47羟基化代谢产物的生成,还能加剧BDE47导致的糖脂代谢异常,两者间存在联合效应。4.BDE47导致睾丸毒效应的机制可能同时存在直接和间接两个途径。一方面,BDE47被3A1代谢形成的活性代谢产物3-OH-BDE47破坏了血睾屏障导致睾丸中产物的持续增多,并通过ROS依赖的p53、caspase3、FAS、FASL等多种信号分子参与的细胞凋亡过程诱发直接毒效应；另一方面,BDE47可通过诱发糖脂代谢紊乱,产生高胰岛素血症,并通过上调DAX-1抑制StAR、3β-HSD的表达,导致睾酮合成的抑制,间接影响生殖功能。